グルカゴンアンタゴニスト活性及びｇｌｐ−１アゴニスト活性を有するペプチド模倣体

专利摘要:
本発明は、グルコース依存性インスリン分泌促進剤として主に作用する、式（Ｉ）の新規ペプチド模倣体を提供する。さらに、これらのペプチド模倣体がＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性と共にグルカゴン受容体アンタゴニスト活性を示すことが明らかとなった。
公开号:JP2011506428A
申请号:JP2010537603
申请日:2008-12-10
公开日:2011-03-03
发明作者:アール． ジャイン，ムクル；ラマンバイ パテル，パンカイ；エイチ． バヘカー，ラジェシュ
申请人:カディラ ヘルスケア リミティド；
IPC主号:C07K7-06

专利说明:

[0001] 本発明は、一般式（Ｉ）の新規化合物、それらの互変異性体、それらの医薬として許容される塩、及びそれらを含む医薬組成物に関する。]
[0002] ]
[0003] 本発明はまた、一般式（Ｉ）の化合物、それらの互変異性体、それらの医薬として許容される塩、及びそれらを含む医薬組成物を製造するための方法に関する。]
背景技術

[0004] 発明の背景
糖尿病は、膵臓β細胞からのインスリン分泌の減少、インスリン抵抗性、又はそれらの両方によって特徴付けられる（Ｃａｖａｇｈａｎ，Ｍ．Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２０００，１０６，３２９）。２型糖尿病患者の大部分は、肝臓におけるグルコース産生を減少させる薬剤（グルカゴンアンタゴニスト）、ＧＩＴからのグルコース吸収を減少させる薬剤、β細胞機能を刺激する薬剤（インスリン分泌促進剤）、又はインスリンに対する患者の組織感受性を向上させる薬剤（インスリン感受性改善薬（ｉｎｓｕｌｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｒ））で処理され得る。２型糖尿病を処置するために現在使用されている薬剤は、α−グルコシダーゼ阻害剤、インスリン感受性改善薬、インスリン分泌促進剤、及びＫATPチャンネル遮断薬を含む（Ｃｈｅｈａｄｅ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｒｕｇｓ，２０００，６０，９５）。しかし、ほぼ半数の２型糖尿病の対象は、長年にわたり、これらの薬剤に対する応答性を失い、それによりインスリン療法を必要とする。インスリン療法は、幾つかの欠点を有し、それは注射物質であり、低血糖を引き起こし、そして体重増加を引き起こす（Ｂｕｒｇｅ，Ｍ．Ｒ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓ．Ｍｅｔａｂ．，１９９９，１，１９９）。]
[0005] 現在の治療における問題により、２型糖尿病を処置するための新規治療法が必要とされている。これに関連して、膵臓におけるグルコース依存性インスリン分泌を促進するグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）アゴニスト、並びに糖原病及び糖新生を阻害することによって肝臓におけるグルコース産生を阻害するグルカゴン受容体アンタゴニストが、治療への潜在性があることが見出された。したがって、ＧＬＰ−１アゴニスト及びグルカゴンアンタゴニストは共に、循環グルコースレベルを減少させ、そして２型糖尿病の処置及び予防のための有用な治療剤となることが明らかとなった（Ｐｅｒｒｙ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，ＴｒｅｎｄｓＰｈａｒｍａｃｏｌ．Ｓｃｉ，２００３，２４，３７７）。]
[0006] グルカゴン及びＧＬＰ−１は、構造的に関連のあるペプチドホルモンファミリー（セレクチンファミリー）のメンバーである。グルカゴン及びＧＬＰ−１は、共通の前駆体であるプレプログルカゴンが起源であり、そしてそれは組織特異的処理時において、主に腸におけるＧＬＰ−１の産生及び膵臓におけるグルカゴンの産生をもたらすため、これら二つのホルモンは、高い相同性を有する一連のペプチドを構成する（Ｊｉａｎｇ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，２００３，２８４，Ｅ６７１−６７８）。これら二つのペプチドの受容体は相同的であり（５８％の同一性）、そしてＧタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）のクラスＢファミリーに属する。クラスＢ ＧＰＣＲはまた、セクレチン受容体ファミリーと呼ばれ、そしてそれは１５個のヒトにおけるペプチド結合性受容体からなる。ＧＰＣＲ受容体は、介在ループを有する、７回膜貫通αへリックスからなる膜近傍ドメイン（Ｊ−ドメイン）と連結する、１００〜１６０残基の細胞外Ｎ末端ドメイン、及びＣ末端テールを含む（Ｂｒｕｂａｋｅｒ，Ｐ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ Ｃｈａｎｎｅｌｓ，２００２，８，１７９）。クラスＢ ＧＰＣＲは、中程度の大きさ、典型的には３０〜４０個のアミノ酸の内因性ペプチドリガンドによって活性化される（Ｈｏａｒｅ，Ｓ．Ｒ．Ｊ．，Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｔｏｄａｙ，２００５，１０，４２３；Ｇｅｔｈｅｒ，Ｕ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ，２０００，２１，９０）。]
[0007] グルカゴンは、ＰＣ２によって膵臓のα細胞中のプログルカゴンから処理された、２９個のアミノ酸ペプチドホルモンである。グルカゴンは、４８５個のアミノ酸からなる、７回膜貫通ＧＰＣＲを通じて作用する。循環グルコースが低いとき、グルカゴンが血流へと放出される。グルカゴンの主な生理学的役割は、肝臓のグルコース産出を刺激し、それにより血糖の増加を導くことである（Ｔａｎ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，１９８５，２８，４３５）。グルカゴンは、インスリンがインビボにおけるグルコース恒常性を維持するときに、主な対抗制御的機構を提供する。グルカゴン及びその受容体は、糖尿病の治療のための潜在的標的となる。グルカゴン受容体において、分泌されたグルカゴンの作用を遮断することによって、又はグルカゴン産生自体を阻害する（抑制する）ことによってグルカゴンの作用をアンタゴナイズすることは、糖尿病及び代謝性疾患の治療介入のための新規手段を示す（Ｕｎｓｏｎ，Ｃ．Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，１９８９，１０，１１７１；Ｐａｒｋｅｒ，Ｊ．Ｃ，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２０００，４９，２０７９；Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８２，２１５，１１１５；Ａｈｎ，Ｊ．Ｍ．，ＪＭＣ，２００１，４４（９），１３７２−１３７９）。]
[0008] ＧＬＰ１（７〜３６）アミドは、食物消化に対する応答において、腸のＬ細胞から分泌される、プレプログルカゴン遺伝子の産物である。ＧＬＰ−１の生理学的作用は、かなりの関心を得ている。ＧＬＰ−１は、グルコース依存的に、膵臓のβ細胞からのインスリン分泌を刺激することによって（インスリン分泌作用）、複数の作用を発揮する。ＧＬＰ−１は、α細胞からのグルカゴン分泌（産生）を阻害することによって、循環血漿グルカゴン濃度を低下させる（Ｄｒｕｃｋｅｒ Ｄ．Ｊ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２００１，１４２，５２１−５２７）。ＧＬＰ−１はまた、ベータ細胞増殖の刺激、食欲抑制、胃内容排出の遅延、及びインスリン感受性の刺激のような特性を示す（Ｎａｕｃｋ，Ｍ．Ａ．，Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．，２００４，３６，８５２）。現在、ＧＬＰ−１及びＥＸ−４の種々の類縁体、例えばリラグルチド（Ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）／ＮＮ２２１１（Ｎｏｖｏ Ｎｏｒｄｉｓｋ；フェーズＩＩＩ；国際公開第１９９８００８８７１号）、ＢＩＭ５１０７７（Ｉｐｓｅｎ；フェーズＩＩ；国際公開第２００００３４３３１号）、ＣＪＣ−１１３１（ＣｏｎｊｕＣｈｅｍ；フェーズＩＩ；国際公開第２００００６９９１１号）及びＺＰ−１０（Ｚｅａｌａｎｄ及びＡｖｅｎｔｉｓ；フェーズＩＩ；国際公開第２００１００４１５６号）は、異なる段階の臨床開発にある。近年、バイエッタ（ＢＹＥＴＴＡ）（登録商標）（エキセンディン（Ｅｘｅｎｄｉｎ）−４）が、米国市場において上市された（Ａｍｙｌｉｎ及びＬｉｌｌｙ）。しかし、全ての既存のＧＬＰ−１アゴニストは、非経口経路の投与によって送達され、したがって、既存のＧＬＰ−１系治療における患者のインコンプライアンス（ｉｎｃｏｍｐｌｉａｎｃｅ）が主な問題である。]
[0009] グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体のエフェクター系は、アデニリル・シクラーゼ（ＡＣ）酵素である。グルカゴン又はＧＬＰ-１アゴニストと、グルカゴン又はＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１ Ｒ）との相互作用はそれぞれ、ＡＣの活性化を引き起こし、そしてそれはＡＴＰをｃＡＴＰへと変換する。細胞内ｃＡＭＰレベルの増大は、ＡＤＰ／ＡＴＰ比を増大させ、それによりＫATPチャンネルの閉鎖による細胞脱分極を引き起こす。細胞内ｃＡＭＰレベルの増大はまた、タンパク質キナーゼ（ＰＫ−Ａ及びＰＫ−Ｃ）を活性化し、そしてそれは、ＬタイプのＣａ2+チャンネルが開くことによってシストリック（ｃｙｓｔｏｌｉｃ）Ｃａ2+濃度を増大させる。細胞内Ｃａ2+濃度の増大は、膵臓のβ細胞におけるインスリンの、及びα細胞中のグルカゴンペプチドの開口分泌をもたらす（Ｆｅｈｍａｎｎ，Ｈ．Ｃ．，Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．，１９９５，１６，３９０）。]
[0010] 以下に示されたＧＬＰ−１及びグルカゴン配列のアラインメントは、一次構造の関係を表す：]
[0011] ]
[0012] Ｃ末端アミドを有するＧＬＰ−１ペプチドの、Ｎ末端の最初の１〜９個の残基は：]
[0013] ]
[0014] であり、正味の電荷はマイナスである。]
[0015] Ｃ末端アミドを有するグルカゴンペプチドの、Ｎ末端の最初の１〜９個の残基は：]
[0016] ]
[0017] であり、正味の電荷は中性である。]
[0018] アミノ酸の一文字略記は、Ｚｕｂａｙ，Ｇ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２ndｅｄ．，１９８８，ＭａｃＭｉｌｌａｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐ．３３において見られる。]
[0019] 天然の又は合成ＧＬＰ−１ペプチドは、速やかに代謝される。タンパク質分解性酵素、例えばジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ（ＤＰＰ−ＩＶ）によって速やかに代謝されて不活性な代謝物となり、それによりＧＬＰ−１の薬剤としての使用が限定される（Ｄｅａｃｏｎ，Ｃ．Ｆ．，Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，２００５，１２８，１１７）。同様に、幾つかの、種々の構造の非ペプチジル及びペプチジルグルカゴン受容体アンタゴニストは近年報告されているが、それらのいずれも、活発に開発中又は臨床開発中ではない（Ｋｕｒｕｋｕｌａｓｕｒｉｙａ，Ｒ．，Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｐａｔｅｎｔｓ，２００５，１５，１７３９；Ｌａｕ，Ｊ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００７，５０，１１３；Ｐｅｔｅｒｓｅｎ，Ｋ．Ｆ．Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ，２００１，４４，２０１８；Ｃａｓｃｉｅｒｉ，Ｍ．Ａ．，ＪＢＣ，１９９９，２７４，８６９４）。クラスＢ ＧＰＣＲのための非ペプチドリガンド（特にアゴニスト）を同定することが、創薬における主要な障壁であると考えられている。ＨＴＳは、一見幾つかのヒットを生み出したが（米国特許出願公開第２００５／６９２７２１４号明細書；国際公開第２０００／０４２０２６号；米国特許第２００７／００４３０９３号明細書）、対応する受容体に対してヒットしたスクリーニング物は、特にインビボ条件下（動物モデル）において、偽陰性である傾向にある（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｋ．Ｇ．，ＰＮＡＳ，２００７，１０４，６８９）。]
[0020] グルカゴン及びＧＬＰ−１は、全体のグルコース恒常性において、いずれも大きな役割を果たす（Ｄｒｕｃｋｅｒ，Ｄ．Ｊ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２００７，１１７，２４；Ｂｏｌｌｙｋｙ，Ｊ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，２００７，９２，２８７９）。グルカゴンは、肝臓中におけるグルコース新生を刺激することによって、血漿グルコース濃度を増大させる一方で、ＧＬＰ−１はグルコース依存性インスリン分泌によって媒介される血漿グルコース濃度を低下させる（Ｍｏｊｓｏｖ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ，１９９０，２６５，８００１）。正常な血液グルコース濃度を維持するときに、グルカゴンペプチド及びＧＬＰ−１の両方の重要性を知ることによって、グルカゴン受容体アンタゴニスト及びＧＬＰ−１受容体アゴニストとして作用する、単一のリガンドを同定することへのかなりの関心が近年存在する（Ｃｌａｕｓ，Ｔ．Ｈ．，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２００７，１９２，３７１；Ｐａｎ Ｃ．Ｑ．，ＪＢＣ，２００６，２８１，１２５０６）。]
[0021] 強力な非ペプチドＧＬＰ−１アゴニストの同定は困難かもしれないが（Ｃｈｅｎ，Ｄ．，ＰＮＡＳ，２００７，１０４，９４３；Ｋｎｕｄｓｅｎ，Ｌ．Ｂ．，ＰＮＡＳ，２００７，１０４，９３７）、グルカゴンアンタゴニスト及びＧＬＰ−１受容体アゴニストの両方として作用するハイブリッドペプチド模倣体の設計は、２型糖尿病の処置のための新規方法を提供する可能性がある（Ｃｌａｕｓ，Ｔ．Ｈ．，Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２００７，１９２，３７１）。近年、一連のキメラペプチドが報告され、そしてそれらはＧＬＰ−１受容体アゴニスト及びグルカゴン受容体アンタゴニストの両方として作用し、そしてそれらは、グルカゴンペプチドのＮ末端残基（１〜２６番目の残基）を、ＧＬＰ−１ペプチドの最後のＣ末端４残基（ＶＫＧＲ）と結合することによって主に構築された（Ｐａｎ Ｃ．Ｑ．，ｅｔ ａｌ．，米国特許第６８６４０６９Ｂ２号明細書；Ｐａｎ Ｃ．Ｑ．，ＪＢＣ，２００６，２８１，１２５０６）。]
[0022] グルカゴン及びＧＬＰ−１配列の両方における個々のアミノ酸の役割を決定するための構造活性相関（ＳＡＲ）研究が、文献において報告された（Ｒｕｎｇｅ，Ｓ．，ＪＢＣ，２００３，２７８，２８００５；Ｍａｎｎ，Ｒ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．，２００７，３５，７１３）。グルカゴン及びＧＬＰ−１は、水溶液中で明確な構造を有していないが、ミセルの存在下又は膜模倣環境下において、それらは中央部において、柔軟なＮ末端及びＣ末端領域を有する、アルファ−へリックス構造をとっている（Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｋ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４，３３，３５３２；Ｎｅｉｄｉｇｈ，Ｊ．Ｗ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００１，４０，１３１８８）。これは、当該へリックス構造が、ペプチドリガンドの、それらの各々の受容体への結合のために必要とされることを示唆している。当該両方のペプチドのＮ末端領域におけるアミノ酸の変異又は欠失は、受容体アンタゴニスト又は不活性化合物をもたらし、そしてそれはグルカゴン及びＧＬＰ−１ペプチドの両方による受容体の活性化のための、Ｎ末端の重要性を示唆している（Ｈｊｏｒｔｈ，Ｓ．Ａ．，ＪＢＣ，１９９４，２６９，３０１２１；Ｇｒｅｅｎ，Ｂ．Ｄ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２００３，３１，５２９）。Ｎ末端の最後から２番目に位置するプロリン又はアラニン残基を含むペプチドを切断することに関与するプロテアーゼであるジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ ＩＶ）によって、インビボにおいてＧＬＰ−１は速やかに分解され、それにより不活性な代謝産物が生じる。ＤＰＰ−ＩＶと反応する部位の置換、例えばＧＬＰ−１ペプチドの２番目の位置にあるＡｌａを、Ｄ−Ａｌａ、Ａｉｂ、又はＨｆｌ（ヘキサフルオロロイシン）へと置換することにより、血漿中における安定性が非常に改善される（Ｄｅａｃｏｎ，Ｃ．Ｆ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，１９９８，４７，７６４；Ｍｅｎｇ，Ｈ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，２００８，５１，７３０３−７３０７）。]
[0023] 本研究において、我々は、グルカゴンペプチドのＮ末端配列（最初の１〜９個の残基、配列番号４）と、２つの非天然アミノ酸のジペプチドとのカップリングにより、多様な程度の選択性で、グルカゴンアンタゴニスト及びＧＬＰ−１アゴニスト活性の両方を有する、新規クラスのペプチド模倣体が同定されることを見出した。作用の持続性及びＤＰＰ−ＩＶ酵素に対する安定性を向上させるために、我々は部位特異的に当該ハイブリッドペプチド模倣体を、Ｚ2位選択的に、非天然アミノ酸、例えばＤ−Ａｌａ、Ａｉｂ、α−メチルプロリン（α−Ｍｅ−Ｐｒｏ）、１−アミノ−シクロペンタンカルボン酸（ＡＰＰ）、及び１−アミノ−シクロプロパンカルボン酸（ＡＣＰ）を用いて修飾し、そして短いペプチド模倣体を同定することに成功した。幾つかのペプチド模倣体は、経口投与経路によってでさえ有効性を示し、一方でグルカゴンアンタゴニスト活性及びＧＬＰ−１アゴニスト活性の両方の維持を示した。]
[0024] 先行技術及び設計戦略
一連のＮ末端修飾されたＧＬＰ−１モジュレータが、一般式Ｘａａ１−Ｘａａ１１で報告されており、ここで式中、Ｘａａ１−Ｘａａ９は、幾つかの類縁体を有する、ＧＬＰ−１ペプチドの最初１〜９個の残基]
[0025] ]
[0026] を示し、Ｘａａ２は、Ａｌａ又は場合によりＡｉｂで置換されたもののいずれかを示し、Ｘａａ３は、カルボン酸の側鎖を有するアミノ酸、例えばグルタミン酸及びアスパラギン酸を示し、しかしそしてそれはグルカゴンペプチドのＮ末端配列]
[0027] ]
[0028] 中に保存されているＧｌｎ（Ｑ）ではない。Ｘａａ６は、Ｐｈｅ又は場合により−α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ−で置換されたものを示し、Ｘａａ９は、カルボン酸又はアミド側鎖を有するアミノ酸、例えばアスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギンなどを示し、Ｘａａ１０は、置換又は未置換のビフェニルアラニン（Ｂｉｐ）誘導体を示し、及びＸａａ１１は、置換若しくは未置換のビフェニルアラニン（Ｂｉｐ）誘導体、又は置換若しくは未置換の２−アミノ−５−フェニル−ペンタン酸（ＡＰＰＡ）誘導体を示す（国際公開第２００３／０３３６７１Ａ２号；米国特許出願公開第２００４／０１２７４２３Ａｌ号明細書；国際公開第２００４／０９４４６１Ａ２号；米国特許出願公開第２００６／０００４２２２Ａ１号明細書；国際公開第２００６／０１４２８７Ａ１号；国際公開第２００６／１２７９４８Ａ２号；国際公開第２００７／０８２２６４Ａ２号；米国特許出願公開第２００７／００２１３４６Ａ１号明細書；米国特許出願公開第２００７／００９９８３５号明細書；米国特許出願公開第２００７／０２３８６６９Ａ１号明細書；国際公開第２００７／１４０２８４Ａ２号；米国特許出願公開第２００６／７１４５０４０Ｂ２号明細書；米国特許出願公開第２００７／７２３８６７１Ｂ２号明細書；米国特許出願公開第２００７／７２３８６７０Ｂ２号明細書；米国特許出願公開第２００７／０２８７６７０Ａ１号明細書；米国特許出願公開第２００８／００４５４６１Ａ１号明細書）。]
[0029] 活性成分として主にグルカゴンペプチドのＮ末端配列（配列番号４の最初の１〜９個の残基）からなり、そしてそれらは結合成分としての２つの非天然アミノ酸（置換又は無置換のビフェニルアラニン（Ｂｉｐ）誘導体）のジペプチドと共有結合しており、そしてグルコース依存的インスリン分泌を主に示す、一連の新規な１１個のアミノ酸ペプチド模倣体が以前に報告されている。さらに、これらのペプチド模倣体は、ＧＬＰ−１受容体活性と共に、グルカゴン受容体アンタゴニスト活性を示した（国際公開第２００８／０６２４５７Ａ２号）。]
[0030] 本発明において、式（Ｉ）の新規ペプチド模倣体（以降、ペプチド模倣体と呼ぶ）が報告される。本発明において、ビフェニルアラニン（Ｂｉｐ）系ジペプチド結合成分の代わりに、我々は、結合成分として置換又は無置換Ｂｉｐ（ＯＭｅ）−ＡＰＰＡ系ジペプチド誘導体を使用した。驚くべきことに、ＧＬＰ−１ペプチドのＮ末端配列の最初の９個の残基]
[0031] ]
[0032] の代わりに、我々がこのジペプチドを、グルカゴンペプチドのＮ末端の最初の９個の残基]
[0033] ]
[0034] へと結合させたとき、このペプチド模倣体]
[0035] ]
[0036] が、図１の通り、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性と共に、グルカゴン受容体アンタゴニスト活性を主に示すことを見出した。] 図１
[0037] 式（Ｉ）の新規ペプチド模倣体は、グルカゴン受容体アンタゴニストとして主に作用し、そしてまた、ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト効果を示す。本発明において報告された異なるペプチド模倣体は、グルカゴン及びＧＬＰ−１受容体に対する異なるレベルの親和性／選択性と共に、（インビトロにおいて）著しいグルコース依存性インスリン分泌を示し、そして（インビボにおいて）循環グルコースレベルの減少を示した。さらに、先に報告されたペプチド模倣体（例えば、国際公開第２００８／０６２４５７Ａ２号中のもの）と比較して、結合成分として置換又は無置換のＢｉｐ（ＯＭｅ）−ＡＰＰＡ系ジペプチド誘導体を有するこれらのペプチド模倣体は、タンパク質分解性の切断への、特にＤＰＰ−ＩＶ、胃内酵素、及び腸内酵素に対する増大した安定性を示した。したがって、幾つかのペプチド模倣体は、ＧＩＴ酵素及び胃の酸性ｐＨに対して安定であり、改善された経口バイオアベイラビリティを有し、それによりそれらが１型及び２型糖尿病の両方、代謝性疾患並びに関連疾患の処置／軽減／予防のための好適な候補品となることを見出した。]
[0038] 発明の概要
本発明は、グルカゴン受容体のアンタゴニスト及びＧＬＰ−１受容体のアゴニストの両方として機能し、両方の受容体に対して異なる程度の親和性／選択性を有し、そして循環グルコースレベルの減少のために、及び糖尿病の処置のために有用である、一群の新規ペプチド模倣体を説明する。これらのペプチド模倣体は、以下の一般式（Ｉ）によって定義される。本発明のペプチド模倣体は、インスリン及びグルカゴンの作用を制御することによって、ヒト又は動物の体の処置に有用である。新規の、及び代謝的に安定な結合成分の組み合わせにより、本発明のペプチド模倣体は、改善された経口バイオアベイラビリティを示し、したがって、１型及び２型糖尿病並びに関連する代謝性疾患の処置／軽減／制御のために好適であることが見出された。]
図面の簡単な説明

[0039] 図１は、配列番号５を用いた、インビトロでのヒトグルカゴン受容体アンタゴニスト活性及びＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性を示す。
図２は、ペプチド模倣体のＦｍｏｃ系固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）において使用される、オルソゴナルに（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌｌｙ）保護されたアミノ酸の例を示す。
図３は、Ｈ ＧＬＰ−１Ｒアッセイにおける、エキセンディン（Ｅｘｅｎｄｉｎ）（図Ａ）、及び配列番号３８（図Ｂ）のインビトロにおけるＤＲＣ及びＥＣ50の決定を示す。
図４は、配列番号３８の腹腔内（ｉ．ｐ．）投与後における、Ｃ５７マウス中のインビボでのグルコース減少を示す。
図５は、配列番号３８の経口（ｐ．ｏ．）投与後における、Ｃ５７マウスにおけるインビボでのグルコース減少を示す。
図６は、配列番号３８の経口（ｐ．ｏ．）投与後における、ｄｂ／ｄｂマウスにおけるインビボでのグルコース減少を示す。
図７は、ビヒクル／試験ペプチド模倣体（配列番号１０、２０、及び２５）の単回経口投与後における、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（インビボ）中の血清インスリンレベルを示す。] 図１ 図２ 図３ 図４ 図５ 図６ 図７
[0040] 好ましい実施形態
本発明の好ましい実施形態は、糖尿病の処置／軽減／制御のために好適である、一般式（Ｉ）の新規ペプチド模倣体、それらの互変異性体、それらの合成に関する新規中間体、それらの医薬として許容される塩、それらの医薬として許容される溶媒和物、及びそれら又はそれらの混合物を含む医薬組成物を提供することである。]
[0041] 別の好ましい実施形態において、一般式（Ｉ）の新規ペプチド模倣体、それらの互変異性体、それらの医薬として許容される塩、医薬として許容される溶媒和物、及びそれらを含む医薬組成物の製造方法が提供される。]
[0042] さらに好ましい実施形態において、医薬上許容される担体、溶媒、希釈剤、賦形剤及びそれらの製造において通常使用される他の媒体を有する、一般式（Ｉ）のペプチド模倣体、それらの互変異性体、それらの医薬として許容される塩、溶媒和物、及びそれらの混合物を含む、医薬組成物が提供される。]
[0043] もう一つのさらなる実施形態において、かかる処置を必要とする哺乳動物へ、治療上有効量かつ無毒性量の、一般式（Ｉ）のペプチド模倣体、又はそれらの医薬として許容される組成物を投与することによる、抗糖尿病剤としての本発明の新規ペプチド模倣体の使用が提供される。]
[0044] 使用される略語
以下の略語は、実施例及び本明細書の他の場所で使用される。
Ａｉｂ＝α−アミノイソ酪酸、
ＡＣＮ＝アセトニトリル、
ＡＰＰＡ＝２−アミノ−５−フェニルペンタン酸、
ＡＣＰＰ＝２−アミノ−５−（３−クロロフェニル）ペンタン酸、
ＡＤＭＰ＝２−アミノ−５−（３，５−ジメチルフェニル）ペンタン酸、
ＡＭＣＢ＝２−アミノ−５−（４−クロロ−２−メチルフェニル）ペンタン酸、
２Ｆ−ＡＰＰＡ＝２−アミノ−５−（２−フルオロフェニル）ペンタン酸、
２，４−ｄｉＦ−ＡＰＰＡ＝２−アミノ−５−（２，４−ジフルオロフェニル）ペンタン酸、
２ＣＦ3−ＡＰＰＡ＝２−アミノ−５−（２−（トリフルオロメチル）フェニル）ペンタン酸、
２ＣＦ3，４Ｆ−ＡＰＰＡ＝２−アミノ−５−（４−フルオロ−２−（トリフルオロメチル）フェニル）ペンタン酸、
２Ｆ，４ＣＦ3−ＡＰＰＡ＝２−アミノ−５−（２−フルオロ−４−（トリフルオロメチル）フェニル）ペンタン酸、
２Ｃｌ−ＡＰＰＡ＝２−アミノ−５−（２−クロロフェニル）ペンタン酸、
２Ｃｌ，４ＯＭｅ−ＡＰＰＡ＝２−アミノ−５−（２−クロロ−４−メトキシフェニル）ペンタン酸、
Ｂｉｐ＝ビフェニルアラニン、
Ｂｉｐ（ＯＭｅ）＝２’−エチル−４’−メトキシ−ビフェニルアラニン、
α−Ｍｅ−Ｂｉｐ（ＯＭｅ）＝α−メチル化Ｂｉｐ（ＯＭｅ）、
Ｎ（Ｍｅ）−Ｂｉｐ（ＯＭｅ）＝Ｎ−メチル化Ｂｉｐ（ＯＭｅ）、
Ｂｎ＝ベンジル、
Ｂｏｃ＝ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、
Ｂｕt＝Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル基、
ｃＡＭＰ＝アデノシン３’，５’−環状モノリン酸、
ＤＣＭ＝ジクロロメタン、
ＤＭＦ＝Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、
ＤＩＰＣＤＩ＝ジイソプロピルカルボジイミド、
ＤＩＰＥＡ＝ジイソプロピルエチルアミン、
Ｅｔ＝エチル、
Ｅｔ2Ｏ＝ジエチルエーテル、
Ｆｍｏｃ＝フルオレニルメトキシカルボニル、
ｇ＝グラム（単数又は複数）、
ＧＬＰ−１Ｒ＝グルカゴン様ペプチド−１受容体、
グルカゴンＲ＝グルカゴン受容体、
ｈ＝時間（単数又は複数）、
Ｈｆｌ＝５，５，５，５’，５’，５’−２Ｓ−ヘキサフルオロロイシン、
ＨＯＢｔ＝ヒドロキシベンゾトリアゾール、
ＨＯＡｔ＝７−アザ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、
ＨＢＴＵ＝２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムヘキサフルオロホスフェート、
ＨＰＬＣ＝高速液体クロマトグラフィー、
ｉ．ｐ．＝腹腔内、
Ｌ＝リットル、
ＬＣ／ＭＳ＝液体クロマトグラフィー／質量分析、
Ｍｅ＝メチル、
Ｍｉｎ＝分（単数又は複数）、
ｍＬ＝ミリリットル、
μｌ＝マイクロリットル、
ｍｇ＝ミリグラム（単数又は複数）、
ｍｍｏｌ＝ミリモル（単数又は複数）、
ＭＳ＝質量分析、
ＰｙＢＯＰ＝ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、
ＳＰＰＳ＝固相ペプチド合成、
ｓｃ＝皮下、
ＴＭＳ＝トリメチルシリル、
ＴＩＰＳ＝トリイソプロピルシラン、
ＴＦＡ＝トリフルオロ酢酸、
ＴＢＴＵ＝２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルアミニウムテトラフルオロボレート、
Ｔｒｔ＝トリチル基。]
[0045] 発明の詳細な説明
本発明に従って、合成ペプチド模倣体は構造式（Ｉ）を有し、そしてそれはグルコース依存的インスリン分泌を示す。さらに、これらのペプチド模倣体は、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性と共に、グルカゴン受容体アンタゴニスト活性を示すことが見出された。これらの二作用性ペプチド模倣体は、タンパク質分解性切断に対する、特にＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼ−ＩＶ）酵素に対する増大した安定性を示す。大部分のペプチド模倣体は、２４時間、ラット血漿中（インビトロ）において安定であることが見出され、ＧＩＴ酵素、例えばペプシンに対して、及び酸性の胃のｐＨに対して、並びに肝臓のミクロソーム（インビトロ）に対して増大した安定性を示した。増大した代謝安定性のために、幾つかのこれらのペプチド模倣体はまた、糖尿病及び関連する代謝性疾患の処置又は予防のために、経口投与経路で送達され得る。]
[0046] ]
[0047] ［式中、
Ａは−ＮＨ−Ｒ1、Ｒ3−ＣＯ−、Ｒ3−Ｏ−ＣＯ−、又はＲ3−ＳＯ2−を示し、ここでＲ1は、水素、又は場合により置換された直鎖又は分岐の（Ｃ1−Ｃ10）アルキル鎖を示し；Ｒ3は、直鎖又は分岐の（Ｃ1−Ｃ10）アルキル、（Ｃ3−Ｃ6）シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、又はアリールアルキル基から選択される。］]
[0048] 好ましい実施形態において、アリール基は、フェニル、ジフェニル、ナフチル、インダニル、フルオレニル、又はビフェニル基から選択され、ヘテロアリール基は、ピリジル、チエニル、フリル、イミダゾリル、ベンゾフラニル基から選択される。]
[0049] Ｂは、−ＣＯＯＲ2、−ＣＯＮＨＲ2、又はＣＨ2ＯＲ2を示し、ここでＲ2は、水素、先に定義された、直鎖若しくは分岐の（Ｃ1−Ｃ10）アルキル基、アリール又はアラルキル基から選択される、場合により置換された基を示す。]
[0050] Ｚ1〜Ｚ11は、他に指定されない限り、アミド結合によって連結した、天然又は非天然アミノ酸を示す。]
[0051] Ｚ1は、Ｌ−ヒスチジン（Ｈ）、Ｄ−ヒスチジン（ｄＨ）、又はウロカニン酸（ＵＡ）を示す。]
[0052] ]
[0053] Ｚ2は、Ｌ−セリン（Ｓ）、Ｄ−セリン（ｄＳ）、Ｌ−アラニン（Ａ）、Ｄ−アラニン（ｄＡ）、α−メチルプロリン（α−Ｍｅ−Ｐｒｏ）、α−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）、１−アミノシクロプロパンカルボン酸（ＡＣＰ）、１−アミノ−シクロペンタンカルボン酸（ＡＰＰ）を含む群から選択される、天然又は非天然のアミノ酸を示す。]
[0054] ]
[0055] Ｚ3は、Ｌ−グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、Ｄ−グルタミン（ｄＱ）、又は式ＩＩの化合物（ＣＮＢ、又はＨｆｌ）を示す。]
[0056] ]
[0057] Ｚ4は、グリシン（Ｇ）、又は非天然アミノ酸である１−アミノシクロプロパンカルボン酸（ＡＣＰ）、又は１−アミノ−シクロペンタンカルボン酸（ＡＰＰ）を示す。]
[0058] Ｚ5は、ヒドロキシル側鎖を含む、天然又は非天然のアミノ酸を示し；好ましいＺ5は、Ｌ−スレオニン（Ｔ）、Ｄ−スレオニン（ｄＴ）、Ｌ−アロスレオニン（ａｌｌｏ−Ｔｈｒ；ａｌｌｏ−Ｔ）、Ｄ−アロスレオニン（ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ；ｄ−ａｌｌｏ−Ｔ）である。]
[0059] Ｚ6は、二つの側鎖を有する、二置換されたアルファ炭素を有する、天然又は非天然のアミノ酸を示し、ここで前記側鎖の各々は独立して、場合により置換されたアルキル又はアリール又はアラルキル基であり得、ここで前記置換基は、１個以上のアルキル基又は１個以上のハロ基から選択され得る。好ましいＺ6は、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、アルファ−メチル−フェニルアラニン（−α−Ｍｅ−Ｐｈｅ−）、アルファ−メチル−２−フルオロフェニルアラニン（−α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ−）、又はアルファ−メチル−２，６−ジフルオロフェニルアラニン（−α−Ｍｅ−２，６−Ｆ−Ｐｈｅ−）、又は２−フルオロフェニルアラニン（−２Ｆ−Ｐｈｅ−）を示す。]
[0060] ]
[0061] Ｚ7及びＺ8は独立して、ヒドロキシル側鎖を有する天然又は非天然アミノ酸を示し、好ましいＺ7及びＺ8は、先に定義されたスレオニン、セリン、１−アミノシクロプロパンカルボン酸（ＡＣＰ）から独立して選択される。]
[0062] Ｚ9は独立して、酸性基を含むアミノ酸側鎖を有する、天然又は非天然のアミノ酸を示す。好ましいＺ9は、Ｌ−アスパラギン酸（Ｄ）、Ｄ−アスパラギン酸（ｄＤ）、又は先に定義した式ＩＩの化合物から選択される。]
[0063] Ｚ10は、置換又は無置換の２’−エチル−４’−メトキシ−ビフェニルアラニン（Ｂｉｐ（ＯＭｅ））及びその誘導体から選択される、式ＩＩＩ（ａ〜ｃ）のＬ又はＤ非天然アミノ酸を示す。]
[0064] ]
[0065] Ｚ11は、置換又は無置換の２−アミノ−５−フェニル−ペンタン酸（ＡＰＰＡ）及びその誘導体から選択される、式ＩＶ（ａ〜ｌ）の、Ｌ又はＤ非天然アミノ酸を示す。]
[0066] さらなる実施形態において、Ｚ9とＺ10との間の、又はＺ10とＺ11との間の、又はＺ9〜Ｚ11のアミド結合は、Ｎ−メチル化され得、Ｄ−（ＮＭｅ）−（Ｂｉｐ（ＯＭｅ））；（Ｂｉｐ（ＯＭｅ））−（ＮＭｅ）−ＡＰＰＡ；Ｄ−（ＮＭｅ）−（Ｂｉｐ（ＯＭｅ））−（ＮＭｅ）−ＡＰＰＡのように、略語「（ＮＭｅ）」で示され；チオアミド結合であり得、Ｄ−（Ｃ＝Ｓ）−（Ｂｉｐ（ＯＭｅ））；Ｂｉｐ（ＯＭｅ）−（Ｃ＝Ｓ）−（ＡＰＰＡ）；Ｄ−（Ｃ＝Ｓ）−（Ｂｉｐ（ＯＭｅ））−（Ｃ−Ｓ）−（ＡＰＰＡ）のように、略語「Ｃ＝Ｓ」で示され、或いはＺ9とＺ10との間の、又はＺ10とＺ11との間の、又はＺ10〜Ｚ11のチオアミド結合は、Ｄ−（ＣＨ2）−（Ｂｉｐ（ＯＭｅ））；Ｂｉｐ（ＯＭｅ）−（ＣＨ2）−（ＡＰＰＡ）；Ｄ−（ＣＨ2）−（Ｂｉｐ（ＯＭｅ））−（ＣＨ2）−（ＡＰＰＡ）のように、「−ＣＨ2−」基（デスオキソペプチド）へと還元され得る。]
[0067] ]
[0068] 定義：
用語「天然アミノ酸」は、天然に存在する２０個のアミノ酸の全てを示す。]
[0069] 用語「非天然アミノ酸」又は「天然ではないアミノ酸」は、Ｌ−アミノ酸と、対応するＤ−アミノ酸との置換、例えばＬ−ＡｌａとＤ−Ａｌａとの置換など、或いは以下のいずれかによる、Ｌ若しくはＤアミノ酸又はアミノアルキル酸の好適な修飾を示す；
−α−アルキル化、例えばＡｌａとα−メチルＡｌａ（Ａｉｂ）との置換、Ｐｈｅとアルファ−メチル−フェニルアラニン（−α−Ｍｅ−Ｐｈｅ−）、アルファ−メチル−２−フルオロフェニルアラニン（−α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ−）、又はアルファ−メチル−２，６−ジフルオロフェニルアラニン（−α−Ｍｅ−２，６−Ｆ−Ｐｈｅ−）との置換；
−アミノ酸の側鎖の置換、例えば、芳香族アミノ酸側鎖とハロゲン、（Ｃ1−Ｃ3）アルキル、アリール基との置換、より具体的には、Ｐｈｅとアルファ−メチル−２−フルオロフェニルアラニン（−α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ−）、又はアルファ−メチル−２，６−ジフルオロフェニルアラニン（−α−Ｍｅ−２，６−Ｆ−Ｐｈｅ−）との置換；
−（ＮＭｅ）−Ｂｉｐ（ＯＭｅ）又は（ＮＭｅ）−ＡＰＰＡのような、略語「（ＮＭｅ）」で示される、アミノ酸のＮ−メチル化；
−アミド結合と、略語「Ｃ＝Ｓ」で示されるチオアミド結合との置換、ジペプチドのアミドからチオアミドへの修飾は、ローソン試薬を使用する保護されたジペプチドの処理によって、化学的に、液相中又は固相上のいずれかでなされ得る。さらに、ジペプチド間のチオアミド結合は、ホウ化ニッケルを用いた還元を使用して、「−ＣＨ2−」基（デスオキソペプチド）へと変換され得る。（Ｊｒ．Ｇｕｚｉｅｃ，Ｆ．Ｓ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１９９０，３１（１），２３−２６）。]
[0070] 本明細書中、任意の場所で使用される種々の基、ラジカル、及び置換基は、以下の段落中で説明される。]
[0071] 本明細書で使用される用語「アルキル」は、単体で、又は他の基と組み合わせて、１〜１０個の炭素を含む、直鎖又は分岐の基を意味し、例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、アミル、ｔ−アミル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、ヘプチル、オクチル、デシルなどである。]
[0072] 本明細書で使用される用語「シクロアルキル」は、単体で、又は他の基と組み合わせて、３〜７個の炭素を含む基を意味し、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチルなどである。]
[0073] 本明細書で使用される用語「アリール」又は「芳香族」は、単体で、又は他の基と組み合わせて、１個、２個、又は３個の環を含む芳香族系を意味し、かかる環は、ペンダント型に結合されているか、又は縮合されており、例えばフェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダン、ビフェニルなどである。]
[0074] 用語「アリールアルキル」は、アリールと結合した、上で定義されたアルキル基を意味し、例えばベンジル、フェニルエチル、ナフチルメチルなどである。用語「アリールオキシ」は、アルコキシ基と結合した、上で定義されたアリール基のことであり、例えばフェノキシ、ナフチルオキシなどであり、そしてそれらは置換され得る。]
[0075] 用語「アラルコキシ」は、上で定義されたアリールアルキル基を意味し、例えば、ベンジルオキシ、フェネチルオキシ、ナフチルメチルオキシ、フェニルプロピルオキシなどであり、そしてそれらは置換され得る。]
[0076] 本明細書において使用される用語「ヘテロアリール」又は「複素環」は、単体で、又は他の基と組み合わせて、１個、２個、又は３個の環を含む芳香族系を意味し、かかる環は、Ｏ、Ｎ又はＳから選択される１個以上のヘテロ原子を含み、ペンダント型に結合されているか、又は縮合されている。]
[0077] 本明細書において使用される用語「ヘテロアラルキル」は、単体で、又は他の基と組み合わせて、１〜６個の炭素を含む、直鎖又は分岐の飽和炭素鎖と結合した、上で定義されたヘテロアリール基を意味する。用語「ヘテロアリールオキシ」、「ヘテロアラルコキシ」、「ヘテロシクロキシ」はそれぞれ、酸素原子と結合した、上で定義されたヘテロアリール基、ヘテロアリールアルキル基を意味する。]
[0078] 本明細書において使用される用語「アシル」は、単体で、又は他の基と組み合わせて、１個〜８個の炭素を含む基を意味し、例えばホルミル、アセチル、プロパノイル、ブタノイル、イソブタノイル、ペンタノイル、ヘキサノイル、ヘプタノイル、ベンゾイルなどであり、そしてそれらは置換され得る。]
[0079] 本明細書において使用される用語「カルボン酸」は、単体で、又は他の基と組み合わせて、−ＣＯＯＨ基を意味し、そしてカルボン酸誘導体、例えばエステル及びアミドを含む。本明細書において使用される用語「エステル」は、単体で、又は他の基と組み合わせて、−ＣＯＯ−基を意味し、そしてカルボン酸誘導体を含み、ここでエステル基は、アルコキシカルボニル、例えばメトキシカルボニル、エトキシカルボニルなどであり、そしてそれらは置換され得る。]
[0080] 他で示されない限り、単体で又は他の基の一部として本明細書中で使用される用語「アミノ酸」は、限定されないが、アミノ基及びカルボキシル基が、「α」炭素と呼ばれる同一炭素で結合したものを含む。]
[0081] 「α」炭素における「Ｓ」絶対配置は、一般的に「Ｌ」、又は天然の立体配置のことである。「α」炭素における「Ｒ」絶対配置は、一般的に「Ｄ」アミノ酸のことである。「α置換基」の両方が同一である場合、例えば水素又はメチルである場合において、アミノ酸は、Ｇｌｙ又はＡｉｂであり、そしてそれはキラルではない。小文字のｄは、Ｄ−アミノ酸のキラリティを示す。本明細書において、任意のアミノ酸が記載される場合においてはいつでも、特に他に指定されない限り、それはＬ及びＤ体の両方を含む。したがって、表２は、本発明において製造されたペプチド模倣体のリストを提供し、そしてその中において、個々のアミノ酸は「Ｌ」又は「Ｄ」のいずれかで存在し得る。]
[0082] 用語「受容体アンタゴニスト」は、受容体の活性化、及びセカンドメッセンジャー、例えば環状ＡＭＰの発生を、競合的又は非競合的結合のいずれかによって阻害する。]
[0083] 用語「グルカゴン受容体アンタゴニスト」は、グルカゴン受容体の活性化を阻害する化合物のことである。]
[0084] 用語「ＧＬＰ−１受容体モジュレータ又はアゴニスト」は、ＧＬＰ−１受容体において、下流シグナリング事象、例えばｃＡＭＰ産生及びインスリン放出を制限するその能力を変化させるように作用する化合物のことである。受容体モジュレータの例は、アゴニスト、パーシャルアゴニスト、インバースアゴニスト、及びアロステリックポテンシエーターを含む。]
[0085] 本発明に従って、本明細書に記載された、単離された合成ペプチド模倣体は、グルカゴン受容体アンタゴニストとして主に作用する。さらに、これらのペプチド模倣体はまた、ＧＬＰ−１受容体アゴニストとして作用することが見出された。これらの合成ペプチド模倣体は、ヒトグルカゴン又はＧＬＰ−１受容体（ＨグルカゴンＲ、又はＨＧＬＰ−１Ｒ）をトランスフェクトされたＣＨＯ細胞中、インビトロで、１〜１００ｎＭの濃度範囲内で、所望のグルカゴン受容体アンタゴニスト特性、及びＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性を示す。Ｈ ＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性は、放出されたｃＡＭＰ量を定量することによって評価されるが、一方でグルカゴンアンタゴニスト活性は、グルカゴンペプチド存在下、試験ペプチド模倣体によって阻害されるｃＡＭＰ産生量を測定することによって評価される。新規ペプチド模倣体は、ヒトグルカゴン受容体をトランスフェクトされたＣＨＯ細胞において、１〜１００ｎＭの濃度範囲内で、所望のインビトログルカゴン受容体アンタゴニスト活性を示す。製造された試験ペプチド模倣体の幾つかは、グルコース依存性インスリン放出を示し、そして異なる糖尿病動物モデル、例えば高血糖性のＣ５７マウス、ｏｂ／ｏｂ、及びｄｂ／ｄｂマウスにおいてインビボで試験されたとき、低血糖を引き起こすことなく空腹時高血糖を減少させ、したがってそれらは、２型糖尿病の処置及び予防のための理想的な治療候補品となった。これらの新規クラスのペプチド模倣体は、経口経路又は非経口経路の投与によって投与され得る。]
[0086] 本発明は、単体か又は併用のいずれかで使用される、式（Ｉ）のペプチド模倣体の医薬組成物を提供し、及びかかるペプチド模倣体を使用する方法を提供する。特に本発明は、医薬上許容される担体と共に、治療上有効な量の、式（Ｉ）のペプチド模倣体を、単体で又は組み合わせ（単数又は複数）で含む医薬組成物を提供する。]
[0087] 糖尿病、特に２型糖尿病の進行又は発病を処置又は遅延させるための方法をさらに提供し、ここで当該糖尿病は糖尿病の合併症を含み、網膜症、ニューロパシー、ネフロパシー、及び創傷治癒の遅延、並びに関連疾患、例えばインスリン耐性（グルコース恒常性の低下）、高血糖、高インスリン血症、脂肪酸又はグリセロールの血液レベルの上昇、高トリグリセリド血症を含む脂質異常症、シンドロームＸ、アテローム性動脈硬化、及び高血圧を含み、ここで、式（Ｉ）のペプチド模倣体の治療上の有効量又はそれらの組み合わせ（単数又は複数）が、哺乳動物へ、例えばヒト、処理を必要とする患者へと投与される。]
[0088] へプチド模倣体の製造：
本発明のペプチド模倣体を製造するために、ペプチド合成の分野における当業者にとって周知の幾つかの合成経路が使用され得る。全ての記号が先に定義されたとおりである式（Ｉ）のペプチド模倣体は、ペプチド合成の分野における当業者に周知の従来技術と共に、以下に記載された方法を使用して、又は当業者によって理解されるそれらの変形を使用して合成され得る。言及される方法は以下に記載されたものを含むが、それらに限定されない。]
[0089] 本明細書において記載されたそれらのペプチド模倣体は、一般的に知られている種々の固相技術、例えば、Ｇ．Ｂａｒａｎｙ ａｎｄ Ｒ．Ｂ．Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，”Ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ”；Ｖｏｌｕｍｅ２−”Ｓｐｅｃｉａｌ ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ Ａ”，ｐｐ．３−２８４，Ｅ．Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８０；及びＪ．Ｍ．Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｙｏｕｎｇ，”Ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”２ｎｄ Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ ＩＩ，１９８４に記載されたものの好適な変形を使用する化学合成によって製造され得る。]
[0090] 本発明のペプチド模倣体を製造するための好ましい方策は、Ｆｍｏｃ系ＳＰＰＳ法の使用に基づき、ここでアミノ酸側鎖の一時的保護のための酸に不安定な保護基、例えばｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、ｔｅｒｔ−ブチル（Ｂｕt）、トリチル（Ｔｒｔ）基と組み合わせて、Ｆｍｏｃ（９−フルオレニル−メチル−メチルオキシカルボニル）基は、α−アミノ基の一時的保護のために使用される（図２）（例えば、Ｅ．Ａｔｈｅｒｔｏｎ ａｎｄ Ｒ．Ｃ． Ｓｈｅｐｐａｒｄの”Ｔｈｅ ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ”；Ｖｏｌｕｍｅ９に記載されている、”Ｔｈｅ Ｆｌｕｏｒｅｎｙｌｍｅｔｈｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ ａｍｉｎｏ ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ ｇｒｏｕｐ”、及び”Ｓｐｅｃｉａｌ ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ ｐｅｐｔｉｄｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ Ｃ”，ｐｐ．１−３８，Ｓ．Ｕｎｄｅｎｆｒｉｅｎｄ ａｎｄ Ｊ．Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９８７を参照）。] 図２
[0091] ペプチド模倣体は、不溶性のポリマー支持体（レジン）上で、Ｃ末端のペプチドから開始して、段階的な方法で合成され得る。一つの実施形態において、当該合成は、ペプチドのＣ末端アミノ酸をレジンへと、アミド、エステル、又はエーテル結合の形成を通じて連結することによって開始される。これにより、生成されたペプチドは、Ｃ末端アミド、カルボン酸、又はアルコールとしてそれぞれ最終的に放出され得る。]
[0092] Ｆｍｏｃ系ＳＰＰＳにおいて、Ｃ末端アミノ酸及び合成中に使用される他の全てのアミノ酸は、（存在するならば）別々に保護された（オルソゴナル保護）、α−アミノ基及び側鎖の官能性を有することが必要とされ、ここでα−アミノ保護基は、合成中にレジンからのペプチドの早期切り出し、又は酸に不安定な保護基を用いて通常保護された側鎖保護基の脱保護をすることなく、好適な塩基、例えば２０％ピペリジン溶液を使用して選択的に除去される。]
[0093] アミノ酸のカップリングは、そのカルボキシル基を活性化して活性化エステルとし、そしてレジンと結合されたＮ末端アミノ酸の保護されていないα−アミノ基と当該活性化エステルとの反応によって行われる。全てのカップリング及び脱保護の後、ペプチジル−レジンが、過剰の溶媒、例えばＤＭＦ、ＤＣＭ、及びジエチルエーテルを用いて洗浄された。一連のα−アミノ基の脱保護及びカップリングが、所望のペプチド配列が組み立てられるまで繰り返される（スキーム１）。ペプチドはその後、副反応を制限するために通常好適なスカベンジャーの存在下、好適な切り出し混合物を使用して、側鎖官能基の付随的脱保護と共にレジンから切り出される。生じるペプチドは、最終的に逆相ＨＰＬＣによって精製される。]
[0094] 最終体のペプチドへの前駆体として必要とされるペプチジル−レジンの合成は、市販の架橋されたポリスチレンポリマーレジン（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）を利用する。Ｃ末端アミノ酸が既に結合した、又は結合していない、Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳレジン、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）−フェノキシアセチル−ｐ−メチルベンズヒドリルアミンレジン（Ｆｍｏｃ−リンクアミドＭＢＨＡレジン）、２−クロロ−トリチル−クロリドレジン、又はｐ−ベンジルオキシベンジルアルコールレジン（ＨＭＰレジン）が、本発明における使用のために好ましい。Ｃ末端アミノ酸が結合されていない場合、ＤＩＰＣＤＩとの反応によって形成された、Ｆｍｏｃ保護されたアミノ酸のＨＯＢｔ活性化エステルによって、その結合が達成される。２−クロロトリチルレジンの場合、第一のＦｍｏｃ保護されたアミノ酸のカップリングが、ＤＩＰＥＡを使用して達成される。次のアミノ酸の組み立てのために、ペプチジルレジンのＮ末端保護は、１０〜２０％ピペリジン溶液を使用して選択的に脱保護された。全てのカップリング及び脱保護の後に、過剰のアミノ酸及びカップリング試薬を、ＤＭＦ、ＤＣＭ及びエーテルを用いた洗浄により除去した。その後のアミノ酸のカップリングは、ＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＢｔ、又はＤＩＰＣＤＩ／ＨＯＡＴから各々製造される、ＨＯＢｔ又はＨＯＡＴ活性エステルを使用して達成され得る。幾つかの困難なカップリングの場合において、特に疎水性であるアミノ酸、又は嵩高い側鎖保護基を有するアミノ酸のカップリングにおいて、完全なカップリングは、非常に効率的なカップリング試薬、例えばＨＢＴＵ、ＰｙＢＯＰ、又はＴＢＴＵと、添加剤、例えばＤＩＰＥＡとの組み合わせを使用して達成され得る。]
[0095] 本明細書に記載されたペプチド模倣体の合成は、回分式又は連続的フローペプチド合成装置、例えばＦｍｏｃ／ｔ−ブチル保護法を利用するＣＳ−Ｂｉｏ又はＡＡＰＰＴＥＣペプチド合成装置によって行われ得る。異なる位置に存在する非天然、非市販のアミノ酸は、一つ以上の当技術分野で既知の方法を使用して、ペプチド鎖へと組み込まれた。一つの方法において、Ｆｍｏｃ保護された非天然アミノ酸は、好適な文献記載の手順を使用して、溶液状態で製造された。例えば、Ｆｍｏｃ保護されたαメチル化アミノ酸、例えばＦｍｏｃ−Ａｉｂ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−（α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−（α−Ｍｅ−２，６−Ｆ−Ｐｈｅ）−ＯＨは、改良された文献記載の手順（Ｂｏｅｓｔｅｎ，Ｗ．Ｈ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，２００１，３（８），１１２１；Ｋａｐａｄｉａ，Ｓ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，ＪＯＣ，２００１，６６，１９０３−１９０５）を使用して製造された。式ＩＶ（ａ〜ｌ）に列挙されたような、Ｎ−Ｆｍｏｃ−２−アミノ−５−フェニル−ペンタン酸（Ｆｍｏｃ−ＡＰＰＡ）及びその誘導体の合成は、改良された文献（Ｂｅｔｓｈｒｕｇｇｅ，Ｊ．Ｖ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，１７５３−１７６２；国際公開第２００３／０８７０３６号）記載の方法を使用して行われた。Ｆｍｏｃ−Ｂｉｐ（ＯＭｅ）−ＯＨ（２’−エチル−４’−メトキシ−ビフェニルアラニン；２−アミノ−３−（２’−エチル−４’−メトキシ−ビフェニル−４−イル）−プロピオン酸）を、文献（Ｋｏｔｈａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ ２００２，５８，９６３３；米国特許出願公開第２００６／０００４２２２Ａｌ号明細書）記載の方法によって製造し、そしてＦｍｏｃ−５，５，５，５’，５’，５’−２Ｓ−ヘキサフルオロロイシン（Ｆｍｏｃ−（Ｈｆｌ）−ＯＨ）を、報告された手順（Ｃｈｉｕ，Ｈ．Ｐ．，Ｃｈｅｎｇ，Ｒ．Ｐ．，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．，２００７，９（２６），５５１７−５５２０）によって製造した。生じる誘導体をその後、ペプチドの段階的合成で使用した。或いは、必要とされる非天然アミノ酸は、有機化学的手順を使用して、直接的にレジン上で構築され、そして直鎖ペプチド鎖が構築された。]
[0096] ]
[0097] 各々のペプチド模倣体のためのペプチド−レジン前駆体は、文献（Ｋｉｎｇ，Ｄ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，１９９０，３６，２５５）に記載された、任意の標準的切り出し手順の好適な変形を使用して切り出しがなされ、そして脱保護がなされ得る。本発明における使用のための好適な使用は、スカベンジャーとしての水及びＴＩＰＳの存在下における、ＴＦＡ切り出し混合物の使用である。通常、ペプチジル−レジンを、ＴＦＡ／水／ＴＩＰＳ（９４：３：３；Ｖ：Ｖ：Ｖ；１０ｍｌ／１００ｍｇのペプチジルレジン）中で１．５〜２時間、室温でインキュベートした。切り出しされたレジンをその後ろ過し、ＴＦＡ溶液を濃縮し、又は減圧下乾燥した。生じる粗精製物のペプチドは沈澱させるか、又はＥｔ2Ｏを用いて洗浄されるか、或いは分取ＨＰＬＣによる精製のために、ＤＭＦ又は５０％酢酸水溶液へと直接再溶解される。]
[0098] 所望の純度を有するペプチド模倣体は、分取ＨＰＬＣを使用した精製によって得られる。粗生成物のペプチドの溶液は、セミ分取カラム（Ｌｕｎａ １０μ；Ｃ18；１００Å）；体積２５０×５０ｍｍへと注入され、そしていずれも０．１％ＴＦＡで緩衝化されている、水中ＡＣＮの直線的グラジエントを用いて、流速１５〜５０ｍｌ／分で溶出され、溶出物はＰＤＡ検出器で２２０ｎｍにて検出される。精製されたペプチド模倣体の構造は、エレクトロスプレー質量分析（ＥＳ−ＭＳ）によって同定され得る。]
[0099] 調製された全てのペプチドは、分取ＨＰＬＣ精製の後、対イオンとしてＴＦＡを使用して、トリフルオロ酢酸塩として単離された。しかし幾つかのペプチドは、好適なイオン交換樹脂床を通すことにより、好ましくは陰イオン交換樹脂であるＤｏｗｅｘＳＢＲＰ（Ｃｌ）、又は同等な塩基性陰イオン交換樹脂を通すことにより脱塩がなされた。幾つかの場合において、希釈された酢酸溶液で溶出させて、好適なイオン交換樹脂を通すことによって、ＴＦＡ対イオンは酢酸イオンで置き換えられる。ペプチドの塩酸塩の調製のために、製造の最後の段階において、酢酸塩である選択されたペプチドは、４ＭのＨＣｌで処理された。生じる溶液を、メンブレンフィルター（０．２μｍ）を通じて濾過し、その後に凍結乾燥して白色〜灰色がかった白色のＨＣｌ塩を得た。当業者の十分範囲内である、同様の技術及び／又はかかる好適な改変に従って、本発明のペプチド模倣体の、他の好適な医薬として許容される塩が製造された。]
[0100] ＳＰＰＳ法を使用する、ペプチド模倣体の一般的製造方法：
レジン上におけるペプチド模倣体の構築：
十分な量（５０〜１００ｍｇ）のＦｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳレジン又はＦｍｏｃ−リンクアミドＭＢＨＡレジン、ローディング：０．５〜０．６ｍｍｏｌ／ｇを、ＤＭＦ中で２〜１０分間膨潤させた（１０〜２０ｍｌ／１００ｍｇレジン）。レジン上のＦｍｏｃ基をその後、１０〜３０分間の１０〜２０％ピペリジン−ＤＭＦ溶液（１０〜３０ｍｌ／１００ｍレジン）を用いたレジンのインキュベーションによって除去した。脱保護されたレジンをろ過し、そして過剰のＤＭＦ、ＤＣＭ及びエーテル（５０ｍｌ×４）で洗浄した。洗浄されたレジンを、新しく蒸留されたＤＭＦ（１ｍｌ／１００ｍｇのレジン）中で、窒素雰囲気下、５分間インキュベートした。第一のＦｍｏｃ保護されたアミノ酸（１〜３当量）、あらかじめ活性化されたＨＯＢｔ（１〜３当量）、及びＤＩＰＣＤＩ（１〜２当量）の０．５Ｍ ＤＭＦ溶液を当該レジンへと加え、その後当該レジンを、窒素雰囲気下で１〜３時間振盪した。カップリングの終結を、定量的ニンヒドリン試験を使用して測定した。最初のアミノ酸のカップリングの後、当該レジンをＤＭＦ、ＤＣＭ及びエーテル（５０ｍｌ×４）で洗浄した。次のアミノ酸のカップリングのために、最初にレジンとカップリングされた第一のアミノ酸におけるＦｍｏｃ保護を、２０％ピペリジン溶液を使用して脱保護し、その後好適なカップリング試薬を使用して、及び上記の通りに、Ｆｍｏｃ保護された第二のアミノ酸をカップリングした。上記の一般的スキーム１のように、脱保護、洗浄、カップリング及び洗浄の繰り返しサイクルは、所望のペプチド鎖がレジン上に構築されるまで行われた。]
[0101] 最終的に、上で製造されたＦｍｏｃ保護されたペプチジル−レジンは、上記の２０％ピペリジン処理によって脱保護され、そして当該ペプチジル−レジンを、ＤＭＦ、ＤＣＭ及びエーテル（５０ｍｌ×４）で洗浄した。所望のペプチドを含有するレジンは窒素圧下、１０〜１５分間乾燥され、そして切り出し／脱保護がなされた。]
[0102] 配列番号３７のペプチド（Ｈ2Ｎ−Ｈ−Ａｉｂ−ＱＧＴ−（α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ）−ＴＳＤ−Ｂｉｐ（ＯＭｅ）−（ＡＰＡ）−ＣＯＮＨ2）の、自動化固相合成の代表的実施例]
[0103] 直鎖ペプチド鎖であるＨ2Ｎ−Ｈ−Ａｉｂ−ＱＧＴ−（α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ）−ＴＳＤ−Ｂｉｐ（ＯＭｅ）−（ＡＰＰＡ）−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳを、Ｆｍｏｃ固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法を使用する、自動化ＣＳ−Ｂｉｏ５３６ ＰｅｐＳｙｎｔｈｅｓｉｓｅｒ（商標）で構築した（スキーム２）。Ｆｍｏｃアミノ酸、及び２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＢＴＵ）を、一緒にバイアル中に詰め、そして合成機のアミノ酸モジュール中に配置した。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ；０．９Ｍ）及びＤＭＦのストック溶液を、試薬ボトル中に乾燥窒素雰囲気下で貯蔵した。レジン、Ｆｍｏｃ−ＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ（０．３８ｍｍｏｌ／ｇ；１ｇ）を真空下Ｐ2Ｏ5で乾燥し（１時間）、新たに蒸留したＤＭＦ（５ｍＬ）で膨潤させた。当該膨潤させたレジンをガラス製カラムへとスラリーにして封入し、そして合成機に配置した。全ての合成サイクルは、流速５ｍＬ／分で行われた（表１）。レジンを新たに蒸留したＤＭＦで１０分間洗浄した。Ｆｍｏｃ基の脱保護を、２０％ピペリジン−ＤＭＦ液で１０分間行い、そしてカラム流出物の３０４ｎｍでのＵＶ検出によって脱保護を測定した。]
[0104] ]
[0105] 過剰のピペリジンを３度の補助的洗浄サイクル、及び蒸留されたＤＭＦでの洗浄サイクルで、各々１５分のサイクルで除去した。アミノ基を、ＤＩＰＥＡ（８当量）の存在下ＴＢＴＵ（３．９当量）であらかじめ活性化されたＦｍｏｃアミノ酸（４当量）で処理し、そして１２０分で回収した。各々のサイクルを１０分のサイクルで行う、４度の補助的洗浄サイクル及び蒸留されたＤＭＦによる洗浄サイクルによって、過剰のアミノ酸及び溶解性の副生物をカラム及びループから除去した。さらに、合成サイクル（脱保護、洗浄、アシル化及び洗浄）を直鎖ペプチドの完全な構築のために繰り返した。最終的な脱保護サイクルを、２０％ピペリジン−ＤＭＦ液を用いて１５分間行い、末端Ｆｍｏｃ基を除去し、その後洗浄サイクルを行った（１０×４分間）。完成したペプチド−レジンをガラスろ過器でろ過し、ＤＭＦ、ＤＣＭ、メタノール、ＤＭＦ及びジエチルエーテル（各々１００ｍＬずつ）を用いて連続的に３回洗浄した。ペプチド−レジンを真空下、−２０℃にてＰ2Ｏ5で２時間乾燥した。ニンヒドリンレジン試験を行い、ペプチドと連結したレジンのＮ末端の遊離のアミノ基を確認した。溶液及びレジンビーズにおける青〜紫の着色の出現は、ペプチドと結合したレジン上における遊離のアミノ基の存在を示し、そして陽性試験であると考えられる。]
[0106] ]
[0107] 小スケールでの切り出しが行われ、ペプチドと結合したレジンの純度が評価された。乾燥ペプチド−レジン（約１０ｍｇ）を、ＴＦＡ、水、トリイソプロピルシラン（９５：２．５：２．５ ｖ／ｖ）の混合物（１ｍＬ）で、時折緩やかに攪拌しながら室温にて９０分間処理した。当該レジンをろ過し、ニートのＴＦＡ（１ｍＬ）で十分に洗浄し、そして全ろ液を減圧下で蒸発乾燥した。残余のＴＦＡを、ジエチルエーテル（２ｍＬ）を用いて３回共沸した。得られた残渣を蒸留水（２ｍＬ）に懸濁し、そして水層をジエチルエーテル（３ｍＬ）にて３回抽出した。水層を分離し、凍結乾燥し、粗精製のペプチドであるＨ2Ｎ−Ｈ−Ａｉｂ−ＱＧＴ−（α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ）−ＴＳＤ−Ｂｉｐ（ＯＭｅ）−（ＡＰＰＡ）−ＣＯＮＨ2を得た。当該凍結乾燥されたペプチド、Ｈ2Ｎ−Ｈ−Ａｉｂ−ＱＧＴ−（α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ）−ＴＳＤ−Ｂｉｐ（ＯＭｅ）−（ＡＰＰＡ）−ＣＯＮＨ2を、０．１％のＴＦＡ水溶液（約１ｍｇ／１ｍＬ）に溶解し、そしてその純度を分析ＲＰ−ＨＰＬＣで分析し、そしてエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）で評価した。パーセント純度：９０％（粗精製のペプチド）。ＥＳＩ−ＭＳ；Ｈ2Ｎ−Ｈ−Ａｉｂ−ＱＧＴ−（α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ）−ＴＳＤ−Ｂｉｐ（ＯＭｅ）−（ＡＰＰＡ）−ＣＯＮＨ2における計算値：１４６５（Ｍ+）、１４８７（Ｍ＋Ｎａ+）及び１５０３（Ｍ＋Ｋ+）；実測値（ｍ／ｚ）：１４６５（Ｍ+）、１４８７（Ｍ＋Ｎａ+）、及び１５０３（Ｍ＋Ｋ+）。]
[0108] 上記手順、及び当業者の範囲内にあるその好適な変形を用いて、Ｆｍｏｃ−ＳＰＰＳ法を使用して、本発明で設計されたペプチド模倣体を製造した。さらに、レジンに結合したペプチド模倣体の切り出し及び脱保護を行い、精製し、そして以下の手順を使用して評価した。]
[0109] 切り出し及び脱保護：
所望のペプチド模倣体をそれらの各々のペプチジル−レジンから、ＴＦＡ切り出し混合物を用いて、以下のように切り出し及び脱保護を行った。ＴＦＡ／水／トリイソプロピルシラン（９５：２．５：２．５）（１０ｍｌ／１００ｍｇのペプチジル−レジン）の溶液をペプチジル−レジンへと加え、そして当該混合物を、時折攪拌しながら室温で維持した。当該レジンをろ過し、切り出し混合物で洗浄し、そして合わせたろ液を蒸発乾燥させた。得られた残渣を１０ｍｌの水に溶解し、そして水層をエーテル（各々２０ｍＬ）で３回抽出し、そして最終的に当該水層を凍結乾燥した。凍結乾燥後に得られた粗精製のペプチドを以下のように分取ＨＰＬＣによって精製した：]
[0110] 粗精製ペプチド模倣体の分取ＨＰＬＣ精製
分取ＨＰＬＣを、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−８Ａ液体クロマトグラフで行った。ＤＭＦ又は水に溶解された粗精製ペプチドの溶液を、セミ分取カラム（Ｌｕｎａ １０μ；Ｃ18；１００Å）、体積２５０×５０ｍｍへと注入し、そしていずれも０．１％ＴＦＡで緩衝化された水中ＡＣＮの直線的グラジエントで、２２０ｎｍにてＰＤＡ検出器で流出物を測定しながら、流速１５〜５０ｍｌ／分で溶出された。５０分間で、１分間あたり１％のグラジエント変化をさせながら、０．１％ＴＦＡで緩衝化された、水−ＡＣＮ混合物の２０％〜７０％の典型的グラジエントを使用した。溶出される所望の産物を、単一の１０〜２０ｍｌのフラクションに回収し、そして各々のＨＰＬＣフラクションの凍結乾燥により、純水なペプチド模倣体をアモルファスの白色粉末として得た。]
[0111] 精製されたペプチド模倣体のＨＰＬＣ分析
上記の分取ＨＰＬＣによる精製の後、各々のペプチドを、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣ−１０ＡＤ分析ＨＰＬＣシステムによる分析ＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。ペプチド模倣体の分析ＨＰＬＣによる分析のために、０．１％ＴＦＡ及びＡＣＮバッファーの直線的グラジエントで、Ｌｕｎａ ５μ；Ｃ18；１００Å、体積２５０×４．６ｍｍカラムを使用し、そしてクロマトグラムの取得を、ＰＤＡ検出器を使用して２２０ｎｍにて行った。]
[0112] 質量分析による評価
個々のペプチドを、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）によって、フローインジェクションか又はＬＣ／ＭＳモードのいずれかで評価した。三連四重極型質量分析装置（ＡＰＩ−３０００（ＭＤＳ−ＳＣＩＥＳ、カナダ）が、陽イオン及び陰イオンエレクトロスプレーモードにおける全ての分析において使用された）。全スキャンデータを、単位分解能（ｕｎｉｔ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）で行われる四重極のマスレンジで得た。全ての場合において、実験的に測定される分子量は計算されたモノアイソトピック分子量の０．５ダルトン以内であった。マスクロマトグラムの定量化が、Ａｎａｌｙｓｔ １．４．１ソフトウェアを使用してなされた。]
[0113] 本明細書に記載された合成法を利用して、他の一般的に既知の技術及びその好適な変形を利用して、以下の新規ペプチド模倣体を製造した。このリストは、種々の群のペプチド模倣体を示し、そしてそれらは本発明に従って合成され、そしてこれらのペプチド模倣体の明らかな変形を少なくとも含むことが期待される。しかし、かかる開示は、本発明の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。表２（ｉ〜ｖ）において、本発明の新規ペプチド模倣体は、それらの対応する配列番号と共に列挙される。]
[0114] ]
[0115] ]
[0116] ]
[0117] ]
[0118] ]
[0119] ]
[0120] ]
[0121] ]
[0122] 新規ペプチド模倣体のインビトロ及びインビボ試験：
上記で製造されたペプチド模倣体を、以下に関して試験した：
ａ）インビトロにおけるグルコース依存性インスリン分泌（ＲＩＮ５Ｆ細胞アッセイスクリーニング手順）；
ｂ）インビトロにおけるＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性（環状ＡＭＰの決定）；
ｃ）インビトロにおけるヒトグルカゴンアンタゴニスト活性（環状ＡＭＰの決定）；
ｄ）ＤＰＰ ＩＶ酵素、ヒト血漿、擬似胃液、腸液、及び肝ミクロソームに対するペプチド模倣体の安定性；及び
ｅ）以下に記載された種々のインビトロ及びインビボアッセイを使用する、試験化合物（ペプチド模倣体）の、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス（インビボ）におけるインビボにおける有効性の実証。]
[0123] インビトロ試験：インビトログルコース依存性インスリン分泌（ＲＩＮ５Ｆ細胞アッセイスクリーニング手順）
加湿インキュベータ（５％ＣＯ2）中３７℃で、ＲＩＮ５Ｆ（ラットインスリノーマ）細胞を、ピルビン酸ナトリウム（１ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ、及びグルコース（４．５ｇ／Ｌ）を追加したＲＰＭＩ１６４０培地にて培養した。トリプシン処理の後、ＲＩＮ５Ｆ細胞を、１２ウェルプレートに、１ウェルあたり０．２×１０6細胞の濃度で蒔いた。当該細胞を一晩増殖させて８０％のコンフルエンスとし、そしてインスリン分泌実験を以下のように行った（Ｍｏｎｔｒｏｓｅ−Ｒａｆｉｚａｄｅｈ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏ．１９９７，１３０，１０９．；Ｗａｎｇ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ ２００１，５，１８２０）。]
[0124] 細胞をＰＢＳ溶液で一度洗浄し、その後、ＮａＣｌ（１１５ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＫＣｌ（４．７ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＣａＣｌ2（１．２８ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ（１．２ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＫＨ2ＰＯ4（１．２ｍｍｏｌ／Ｌ）、ＮａＨＣＯ3（１０ｍｍｏｌ／Ｌ）及びＨＥＰＥＳ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）を含有し、グルコース（１．１ｍＭ）及びＢ．Ｓ．Ａ（０．５％）を含有する、ｐＨ７．４の新鮮なクレブス−リンゲル平衡緩衝液で４０分間インキュベーションした。４０分後に緩衝液を交換し、そしてグルコースの存在下（１６．７ｍＭ）及び不在下（０ｍＭ）の両方で、異なる濃度の試験ペプチド模倣体と共に、当該細胞を３０分間（３７℃にて）インキュベートした。上清を回収し、そして超高感度ラットインスリンＥＬＩＳＡキット（Ｃｒｙｓｔａｌ Ｃｈｅｍ，ＩＬ）によって、インスリン量を測定した。ビシンコニン酸キットを使用して、製造業者（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ，ＭＯ）の手順に従って、上清中のタンパク質を推測した。ウェル間の細胞密度における差を正規化するために、ピコグラム（ｐｇ）で得られた全インスリン量を、全タンパク質（μｇ）で割った。代表的ペプチド模倣体の、インビトロにおけるグルコース依存性インスリン分泌活性を表３に列挙する。]
[0125] ]
[0126] ]
[0127] ]
[0128] インビトロにおけるヒトＧＬＰ−１Ｒアゴニスト活性（環状ＡＭＰの決定）
安定にトランスフェクトされたＣＨＯ／ヒトＧＬＰ１Ｒ細胞におけるｃＡＭＰ細胞系アッセイを使用して、新規ペプチド模倣体は、ヒトＧＬＰ−１受容体（ＨＧＬＰ−１Ｒ）アゴニスト活性（インビトロ）に関してスクリーニングされた。ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＣＲＬ９６１８）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得た。Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（２５ｍＭ）、ＮａＨＣＯ3（１．１ｇ／Ｌ）を含有し、そして新生のウシ血清（ＮＢＣＳ；１０％）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ（ｖ／ｖ））及びストレプトマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ（ｖ／ｖ））を追加されたＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地中でＣＨＯ細胞を増殖させた。細胞を３日ごとに１：８に分割した。]
[0129] ヒトＧＬＰ−１受容体を発現する安定なＣＨＯ細胞株の産生
ヒトＧＬＰ−１受容体をコードするｃＤＮＡを、標準的手順に従って、ＲＴ−ＰＣＲによって単離した。完全長ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１（＋）にクローニングした。ＧＬＰ−１受容体を発現するＣＨＯ細胞株の産生のために、ＣＨＯ細胞は、標準的手順に従って、ＣａＰＯ4を使用して、１０μｇの発現プラスミドｐｃＤＮＡ／ｈＧＬＰ−１Ｒを用いてトランスフェクトされた（Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １９９３，１３３，５７）。当該受容体を発現するクローンは、Ｇ４１８（８００μｇ／ｍｌ活性，Ｓｉｇｍａ）選択によって産生された。安定なクローンをその後、５００μｇ／ｍｌ（Ｇ４１８）で維持した。選択されたクローンを、ｃＡＭＰアッセイのために、９〜２５代継代の間で使用した。]
[0130] ｃＡＭＰ産生の決定
ヒトＧＬＰ−１Ｒを安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞は、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ ＮＢＣＳ＋５００ｕｇ／ｍｌ Ｇ４１８中で、７０〜７５％の集密度で維持された。細胞は、２ｍｌのＴＰＶＧ（０．２５％トリプシン、０．５３ｍＭＥＤＴＡ、１．３８ｍＭグルコース）を使用してトリプシン処理された。]
[0131] １０％ＮＢＣＳを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地を使用してトリプシンを不活性化し、そして当該細胞を２ｍｌの完全培地中で懸濁した。２×１０5細胞／ウェルをその後、１２ウェルプレートへ蒔き、そして当該プレートを湿気のある雰囲気下、３７℃にて１６〜１８時間インキュベートした（Ｆｅｈｍａｎｎ，Ｈ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ １９９４，１５，４５３）。次の日にアッセイを行い、このとき当該細胞は９０〜９５％の集密度を示した。１２ウェルプレートから培地を吸引して除き、そして当該細胞をＨａｍ’ｓ Ｆ１２（単純（ｐｌａｉｎ））を使用して一度洗浄した。当該細胞を３７℃で、５００μｌのＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１％ＢＳＡ＋０．１２５ｍＭ ＲＯ−２０を用いて３０分間インキュベートした。インキュベーションの後、当該培地を吸引して除き、そして水（ＭｉｌｌｉＱ）に溶解された５μｌの試験化合物（ペプチド模倣体）を含む新鮮培地（単純Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２＋１％ＢＳＡ＋０．２５ｍＭ ＲＯ−２０）を加えた。湿気のある雰囲気下３７℃にて、試験化合物と共に細胞を３０分間インキュベートした。インキュベーションの後、当該培地を除き、そして細胞を単純Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２で一回洗浄した。その後、各々のウェルへ５００μｌの０．１Ｎ氷冷ＨＣｌを加え、そして２００ｒｐｍで３０分間振盪することによって当該細胞を溶解した。細胞をその後廃棄し、微小遠心管に溶解物を回収し、そして１２０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して細片を除いた。各々の微小遠心管からの３００μｌの上清はその後、ガラス管へと除去され、そしてｃＡＭＰ測定のために、Ｎ2下で３０分間乾燥された。全ｃＡＭＰは、環状ＡＭＰイムノアッセイキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ．ＭＮ）を使用して、製造業者の手順に従って、当該試料から測定された。マイクロＢＣＡ（Ｓｉｇｍａ）を使用してタンパク質濃度を決定するために、残存する上清を使用した。データをパーセント対照（ビヒクル：水）として計算し、そして平均±ＳＤとして表現した。代表的ペプチド模倣体のインビトロにおけるヒトＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性を表４に示す。]
[0132] ]
[0133] ]
[0134] ]
[0135] インビトロにおけるヒトＧＬＰ−１受容体アゴニスト活性に基づいて、新規ペプチド模倣体についてＥＣ50値を決定した。エキセンディン（ＥＣ50＝０．５６ｎＭ）、及び配列番号３８：Ｈ−Ａｉｂ−ＱＧＴ−（α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ）−ＴＳＤ−Ｂｉｐ（ＯＭｅ）−（ＡＤＭＰ）（ＥＣ50＝０．３４ｎＭ）における、比較による用量−反応曲線（ＤＲＣ）を、代表例として図３に示す。] 図３
[0136] インビトロにおける、ヒトグルカゴンアンタゴニスト活性（試験ペプチド模倣体を用いた、環状ＡＭＰ産生量の阻害の測定）]
[0137] ヒトグルカゴン受容体（Ｈ−グルカゴン−Ｒ）アンタゴニスト活性（インビトロ）に関して、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ／ヒトグルカゴンＲ細胞におけるｃＡＭＰ細胞系アッセイを使用して、新規ペプチド模倣体をスクリーニングした。ＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＣＲＬ９６１８）を、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から得た。Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）、ＨＥＰＥＳ（２５ｍＭ）、ＮａＨＣＯ3（１．１ｇ／Ｌ）を含有し、そして新生のウシ血清（ＮＢＣＳ；１０％）、ペニシリン（５０Ｕ／ｍｌ（ｖ／ｖ））及びストレプトマイシン（５０ｕｇ／ｍｌ（ｖ／ｖ））を追加されたＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地中でＣＨＯ細胞を増殖させた。細胞を３日ごとに１：８に分割した。]
[0138] ヒトグルカゴン受容体を発現する安定なＣＨＯ細胞株の産生
ヒトグルカゴン受容体をコードするｃＤＮＡを、標準的手順に従って、ＲＴ−ＰＣＲによって単離した。完全長ｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。グルカゴン受容体を発現するＣＨＯ細胞株の産生のために、ＣＨＯ細胞は、標準的手順に従って、ＣａＰＯ4を使用して、１０μｇの発現プラスミドｐｃＤＮＡ／ｈＧＬＰ−１Ｒを用いてトランスフェクトされた（Ｗｈｅｅｌｅｒ，Ｍ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ １９９３，１３３，５７）。当該受容体を発現するクローンは、Ｇ４１８（８００μｇ／ｍｌ活性，Ｓｉｇｍａ）選択によって産生された。安定なクローンをその後、５００μｇ／ｍｌ（Ｇ４１８）で維持した。選択されたクローンを、ｃＡＭＰアッセイのために、９〜２５代継代の間で使用した。]
[0139] グルカゴンペプチド及び試験ペプチド模倣体の添加後において阻害されるｃＡＭＰ産生量を測定することによる、グルカゴンアンタゴニスト活性の決定]
[0140] ヒトグルカゴンＲを安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞は、Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２＋１０％ＮＢＣＳ＋５００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８中で、７０〜７５％の集密度で維持された。細胞は、２ｍｌのＴＰＶＧ（０．２５％トリプシン、０．５３ｍＭＥＤＴＡ、１．３８ｍＭグルコース）を使用してトリプシン処理された。１０％ＮＢＣＳを含むＨａｍ’ｓ Ｆ１２培地を使用してトリプシンを不活性化し、そして当該細胞を２ｍｌの完全培地中で懸濁した。２×１０5細胞／ウェルをその後、１２ウェルプレートへ蒔き、そして当該プレートを湿気のある雰囲気下、３７℃にて１６〜１８時間インキュベートした。次の日にアッセイを行い、このとき当該細胞は９０〜９５％の集密度を示した。１２ウェルプレートから培地を吸引して除き、そして当該細胞をＨａｍ’ｓ Ｆ１２（単純）を使用して一度洗浄した。当該細胞を３７℃で、５００μｌのＨａｍ’ｓ Ｆ１２＋１％ＢＳＡ＋０．１２５ｍＭ ＲＯ−２０を用いて３０分間インキュベートした。インキュベーションの後、当該培地を吸引して除き、そして水（ＭｉｌｌｉＱ）に溶解された５μｌの試験化合物（ペプチド模倣体）を含む新鮮培地（単純Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２＋１％ＢＳＡ＋０．２５ｍＭ ＲＯ−２０）を加え、その後グルカゴンペプチド（又はアゴニスト）を加えた。湿気のある雰囲気下３７℃にて、ペプチド模倣体及びグルカゴンペプチドと共に細胞を３０分間インキュベートした。インキュベーションの後、当該培地を除き、そして細胞を単純Ｈａｍ’ｓ Ｆ１２で一回洗浄した。その後、各々のウェルへ５００μｌの０．１Ｎ氷冷ＨＣｌを加え、そして２００ｒｐｍで３０分間振盪することによって当該細胞を溶解した。細胞をその後廃棄し、微小遠心管に溶解物を回収し、そして１２０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離して細片を除いた。各々の微小遠心管からの３００μｌの上清はその後、ガラス管へと除去され、そしてｃＡＭＰ測定のために、Ｎ2下で３０分間乾燥された。全ｃＡＭＰは、環状ＡＭＰイムノアッセイキット（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ．ＭＮ）を使用して、製造業者の手順に従って、当該試料から測定された。マイクロＢＣＡ（Ｓｉｇｍａ）を使用してタンパク質濃度を決定するために、残存する上清を使用した。データをパーセント対照（ビヒクル：水）として計算し、そして平均±ＳＤとして表現した。代表的ペプチド模倣体のインビトロにおけるヒトグルカゴン受容体アゴニスト活性を表５に示す。]
[0141] ]
[0142] ]
[0143] ]
[0144] ＤＰＰ ＩＶ酵素、ヒト血漿、擬似胃液、腸液、及び肝ミクロソームに対するペプチド模倣体の安定性]
[0145] 異なるペプチド模倣体（最終濃度２μＭ）は、ＤＰＰ ＩＶ（１：２５ｍＵ）、又は貯蔵されたヒト血漿（７．５μＬ）、又は擬似胃液（ｐＨ１．５；ＨＣｌ、ＮａＣｌ、及びペプシンを配合）、又は擬似腸液（ｐＨ７．５）、又はヒト肝ミクロソームのいずれかを用いて、０、２、４、６、１２及び２４時間インキュベートされた（３７℃；５０ｍＭトリエタノールアミン−ＨＣｌバッファー；ｐＨ７．８）。２〜４時間以内に約５０％の分解が起き、したがって時間依存的分解が２４時間を超えて見られる、ＤＰＰ ＩＶ酵素／ヒト血漿／擬似胃液／擬似腸液／ヒト肝ミクロソームの濃度を、予備試験において選択した。ＴＦＡ／水（１５ｍＬ，１０％（ｖ／ｖ））を加えることによって反応を終結した。反応産物をその後、Ｖｙｄａｃ Ｃ18分析カラム（４．６×２５０ｍｍ）へ適用し、そして主要な分解断片を完全なペプチド模倣体から分離した。カラムをＴＦＡ／水を用いて流速１ｍＬ／分で平衡化した。７０％アセトニトリル／水中、０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡを使用して、溶出溶媒中のアセトニトリル濃度を、０％〜２８％へと１０分かけて、そして２８％〜４２％へと３０分かけて増加させた。ＵＶ検出器を使用して、吸光度を２０６ｎｍで測定し、そしてＥＳＩ−ＭＳ分析に先立ってピークを手動で回収した。試験ペプチド模倣体及びそれらの代謝物について曲線下面積を測定し、そしてパーセント分解を、２４時間の各々の時点において計算した。ＤＰＰ ＩＶ酵素、ヒト血漿、擬似胃液、腸液、及び肝ミクロソームに対する、選択されたペプチド模倣体の安定性試験の結果（インビトロ）を表６に示す。]
[0146] ]
[0147] ]
[0148] ]
[0149] インビボにおける有効性試験：
非経口(ｉ．ｐ．）、及び経口投与経路の両方による、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ又はｄｂ／ｄｂマウスにおける、試験化合物（ペプチド模倣体）のインビボ有効性（抗高血糖／抗糖尿病活性）の実証]
[0150] 動物
急性単回投与における１２０分間の経時変化実験を、社内で繁殖された８〜１２週齢の雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊ又はｄｂ／ｄｂマウスで行った。飼育施設条件（２５±４℃、相対湿度６０〜６５％、午前７時３０分に明かりをつける、１２時間：１２時間の明：暗サイクル）にそれらを馴らすために、１週間、１ケージあたり６匹の動物のグループにして動物を飼育した。全ての実験は、「Ｚｙｄｕｓ研究センター動物倫理委員会（Ｚｙｄｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ａｎｉｍａｌ ｅｔｈｉｃａｌ ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）」による承認に従う、国際的に有効なガイドラインに従って行われた。]
[0151] 手順
幾つかの試験化合物（ペプチド模倣体）及びエキセンディン−４の、インビボにおけるグルコース低下特性を、以下に記載されたＣ５７ＢＬ／６Ｊ（軽度の高血糖）又はｄｂ／ｄｂ動物モデルにおいて評価した。当該試験の２日前、動物を無作為で抽出し、そしてそれらに与えられたグルコースレベルに基づいて、５つのグループ（ｎ＝６）へと分けられた。実験日において、食餌を全てのケージから除き、水を適宜加え、そして一晩維持し、絶食させた。ビヒクル（標準的な生理食塩水）／試験／標準化合物を、体重に基づいて、腹腔内（ｉ．ｐ．）又は経口で投与した。エーテル浅麻酔下で、後眼窩から、０分後すぐに、各々の動物から血液を回収し、その後３０分、６０分及び１２０分又は２４０分まで血液の回収を行った（Ｃｈｅｎ，Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ Ｏｂｅｓｉｔｙ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，２００５，７，３０７．Ｋｉｍ，Ｊ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，２００３，５２，７５１）。]
[0152] 血液試料を遠心分離し、そして分離した血清について速やかにグルコース定量をおこなった。インスリン定量のための血清は、インスリン定量に使用されるまで、−７０℃で貯蔵された。ＤＰＥＣ−ＧＯＤ／ＰＯＤ法（Ｒａｎｂａｘｙ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｉｎｄｉａ）を用いて、９６マイクロウェルプレートリーダー中のＳｐｅｃｔｒａｍａｘ−１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ， Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用してグルコース定量を行った。Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ ｅｘｃｅｌを使用して重複した試料の平均値を計算し、そしてＧｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（Ｖｅｒ４．０）を使用して、０分ベースライン補正された直線グラフ、曲線下面積（０〜１２０分ＡＵＣ）、及びベースライン補正された曲線下面積（０分ＢＣＡＵＣ）を描いた。グラフから得られるＡＵＣ及びＢＣＡＵＣは、Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、一元配置ＡＮＯＶＡで、その後Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ ｐｏｓｔ検定で分析された。さらに、ラット／マウスインスリンＥＬＩＳＡキット（Ｌｉｎｃｏ ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ ＵＳＡ）を使用して、インスリン定量を行った。選択されたペプチド模倣体を用いた、０、３０、６０及び１２０分における血液グルコースレベルの変化を、表７（ｉｐ投与経路）、及び表８（経口投与経路）に各々示す。]
[0153] ]
[0154] ]
[0155] ]
[0156] 配列番号３８（Ｈ−Ａｉｂ−ＱＧＴ−（α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ）−ＴＳＤ−Ｂｉｐ（ＯＭｅ）−（ＡＤＭＰ））を用いて、Ｃ５７マウス中、異なる用量（２／５／８／１０／１５ｎＭ／ｋｇ）にてｉｐ投与経路で急性処置した後（図４）、１００／２００／５００／１０００／２０００ｎＭ／ｋｇの用量での経口投与経路（図５）、又はｄｂ／ｄｂ中、１０００及び２０００ｎＭ／ｋｇ用量での経口投与経路（図６）での、幾つかのベースライン補正された血清グルコースレベルが、代表的な図に示されている。図７は、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウス中、０．５／１／２μＭ／ｋｇ用量（インビボ）での、ビヒクル／試験化合物（配列番号１０（Ｈ−（α−Ｍｅ−Ｐｒｏ）−ＱＧＴＦＴＳＤ−Ｂｉｐ（ＯＭｅ）−（ＡＤＭＰ））、２０（Ｈ−Ａｉｂ−ＱＧＴＦＴＳＤ−Ｂｉｐ（ＯＭｅ）−（ＡＭＣＢ））、及び２５（Ｈ−（ＡＰＰ）−ＱＧＴＦＴＳＤ−Ｂｉｐ（ＯＭｅ）−（ＡＰＰＡ）））の急性経口投与後における血清インスリンレベルの変化を示す。] 図４ 図５ 図６ 図７
[0157] ペプチド模倣体のインビボ及びインビトロでの結果の要約
上記の通り、本発明で製造された全てのペプチド模倣体を、インビトロ及びインビボで評価し、そして選択されたペプチド模倣体のデータを代表的なペプチド模倣体の例として上節で示した。ＲＩＮ５Ｆ（ラットインスリノーマ）細胞系アッセイにおいて、全てのペプチド模倣体は、１〜１０ｎＭ濃度の範囲内でグルコース依存性インスリン分泌のみ示し（表３）、それによりこれらの群のペプチド模倣体は、高血糖性症状の発現を欠く傾向にあり、そしてそれは他の群のインスリン分泌促進剤、例えばスルホニルウレアで一般に観測される。ヒトグルカゴン受容体アッセイにおいて、ペプチド模倣体のインビトロにおけるアンタゴニスト活性を、グルカゴンペプチドと共にインキュベートしたときにおける、試験ペプチド模倣体を用いたｃＡＭＰ産生量の阻害を測定することによって評価した。表５に示す通り、一般的に全てのペプチド模倣体は、１ｎＭ〜１００ｎＭの濃度範囲で著しいグルカゴン受容体アンタゴニスト活性を示した。ＨＧＬＰ−１Ｒアッセイにおいて、新規ペプチド模倣体は、濃度依存的ｃＡＭＰ産生（インビトロＧＬＰ−１アゴニスト活性）を示した（表４）。ペプチド模倣体のこの２重の性質（グルカゴン受容体のアンタゴニスト、かつＧＬＰ−１受容体のアゴニスト）は、それらを２型糖尿病及び関連する代謝性疾患の安全かつ効率的な処置のための理想的な候補品とする。]
[0158] ＤＰＰ−ＩＶ酵素、ヒト血漿、擬似胃及び腸液、並びに肝ミクロソームに対する、選択されたペプチド模倣体の安定性試験の結果は、２４時間インキュベートしたとき、大部分のペプチド模倣体がＤＰＰ−ＩＶ酵素に対して安定であることを示す。同様に、ヒト血漿、擬似胃及び腸液において、大部分のペプチド模倣体は２４時間までインキュベートしたときに安定であることが明らかとなった。ペプチド模倣体を肝ミクロソームと共にインキュベーションしたとき、著しい安定性を示し、そして２６〜３５％の分解のみが２４時間で観察され、そしてそれは幾つかのペプチド模倣体が経口投与経路によって送達され得ることを示した。]
[0159] 非経口及び経口投与経路の両方による、ペプチド模倣体のインビボにおける抗高血糖／抗糖尿病活性が、Ｃ５７又はｄｂ／ｄｂマウスにおいて、急性単回投与での１２０分／２４０分経時変化実験を使用して決定された。表７で示される通り、大部分のペプチド模倣体が、５〜５０ｎＭの用量範囲で、ｉ．ｐ．投与経路経由で活性であり、一方で経口経路においては、幾つかの選択されたペプチド模倣体（表８）は、０．５〜２μＭ／ｋｇ用量の範囲内で活性がある。したがって、新規ペプチド模倣体は、グルカゴンアンタゴニスト活性及びＧＬＰ−１アゴニスト活性を示し、そして経口で生物学的に利用可能であり、そしてそのことは、それらを２型糖尿病及び関連する代謝性疾患の安全かつ効率的な処置のための理想的な候補品とする。]
[0160] 有用性：
好ましい実施形態において、本発明は、両方の受容体に対して異なる程度の親和性／選択性を有する、そして循環グルコースレベルを減少させるため、及び糖尿病の処置のために有用である、グルカゴン受容体のアンタゴニスト、かつＧＬＰ−１受容体のアゴニストの両方として作用するペプチド模倣体を製造する方法を提供する。]
[0161] 本明細書に記載された合成ペプチド模倣体は、グルカゴン又はＨＧＬＰ−１ＲをトランスフェクトされたＣＨＯ細胞中、インビトロにおいて、ｎＭ濃度での所望のグルカゴンアンタゴニスト活性及びＧＬＰ−１アゴニスト活性を示し、そしてインビボにおいて幾つかのペプチド模倣体は、グルコース依存性インスリン放出を示し、そして異なる糖尿病動物モデル、例えば高血糖のＣ５７マウス及びｄｂ／ｄｂマウスで試験したときに、低血糖を引き起こすことなく空腹時高血糖を減少させた。]
[0162] 本発明の新規ペプチド模倣体は、種々のタンパク質分解性酵素に対する安定性の増大を示し、そして増大した安定性かつ短い鎖長のために、かかるペプチド模倣体はまた、経口投与経路で、他の侵襲性及び非侵襲性投与経路で送達され得る。]
[0163] 本発明の新規ペプチド模倣体は、周知である好適な賦形剤と組み合わせることによって、好適な医薬として許容される組成物へと製剤化され得る。]
[0164] 医薬組成物は、従来技術を使用することによって提供される。好ましくは当該組成物は、有効量の活性成分、すなわち単体で又は組み合わせである本発明の式（Ｉ）のペプチド模倣体を含む単位剤形で存在する。]
[0165] 医薬組成物及びその単位剤形中における活性成分、すなわち本発明の式（Ｉ）のペプチド模倣体の量は、特定の適用方法、特定のペプチド模倣体の効能、及び所望の濃度に依存して、高範囲で変化するか又は調節され得る。一般的に、活性成分の量は、組成物の重量に対して０．５％〜９０％の範囲内であろう。]
[0166] したがって、本発明のペプチド模倣体は、限定されないが、糖尿病（好ましくは２型、糖耐性の減少、インスリン抵抗性、及び糖尿病性合併症、例えば腎症、網膜症、ニューロパシー、及び白内障）、高血糖、高インスリン血症、高コレステロール血症、遊離の脂肪酸又はグリセロールの血液レベルの上昇、脂質異常症、高トリグリセリド血症、創傷治癒、組織虚血、アテローム性動脈硬化症、高血圧、腸疾患（例えば壊死性腸炎、微絨毛封入体病（ｍｉｃｒｏｖｉｌｌｕｓ ｉｎｃｌｕｓｉｏｎ ｄｉｓｅａｓｅ）又はセリアック病)の進行又は発病の処置又は遅延を含む種々の病状及び疾患の処置のために、哺乳動物へ、好ましくはヒトへ投与され得る。本発明のペプチド模倣体はまた、高濃度リポタンパク質（ＨＤＬ）の血液レベルの上昇のために利用され得る。]
[0167] さらに、Ｊｏｈａｎｎｓｓｏｎ Ｇ．，Ｊ．，Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，１９９７，８２，７２７に詳細に説明されている、「シンドロームＸ」又はメタボリック症候群とまとめて呼ばれる病状、疾患は、本発明のペプチド模倣体を用いて処理され得る。本発明のペプチド模倣体は、幾つかの上記疾患の処置のために、場合により好適なＤＰＰ−ＩＶ阻害剤と組み合わせて、連続的に当該化合物を投与することによって、又は好適なＤＰＰ−ＩＶ阻害剤と共に本発明のペプチド模倣体を含む組成物としてのいずれかで使用され得る。]
実施例

[0168] 言及された本発明のペプチド模倣体のいずれにおいても、副作用効果が観測されなかった。本発明の化合物は、使用された実験動物中で、すぐれたグルコース血清低下活性を示した。これらのペプチド模倣体は、高インスリン血症、高血糖によって引き起こされる疾患、例えばＮＩＤＤＭ、代謝性疾患の検査／予防のために、かかる疾患が互いに関連しているために使用される。]

权利要求:

請求項1
式（Ｉ）［式中、Ａは−ＮＨ−Ｒ1、Ｒ3−ＣＯ−、Ｒ3−Ｏ−ＣＯ−、又はＲ3−ＳＯ2−を示し、ここでＲ1は、水素、又は場合により置換された直鎖若しくは分岐の（Ｃ1−Ｃ10）アルキル鎖を示し；Ｒ3は、直鎖又は分岐の（Ｃ1−Ｃ10）アルキル、（Ｃ3−Ｃ6）シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、又はアリールアルキル基から選択され；Ｂは、−ＣＯＯＲ2、−ＣＯＮＨＲ2、又はＣＨ2ＯＲ2を示し、ここでＲ2は、水素、又は、直鎖若しくは分岐の（Ｃ1−Ｃ10）アルキル、アリール若しくはアラルキル基から選択される、場合により置換された基を示し；Ｚ1〜Ｚ11は、アミド結合によって連結された、天然又は非天然アミノ酸を示し、ここでＺ1は、Ｌ−ヒスチジン（Ｈ）、Ｄ−ヒスチジン（ｄＨ）、又はウロカニン酸（ＵＡ）を示し；Ｚ2は、Ｌ−セリン（Ｓ）、Ｄ−セリン（ｄＳ）、Ｌ−アラニン（Ａ）、Ｄ−アラニン（ｄＡ）、α−メチルプロリン（α−Ｍｅ−Ｐｒｏ）、α−アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）、１−アミノシクロプロパンカルボン酸（ＡＣＰ）、１−アミノ−シクロペンタンカルボン酸（ＡＰＰ）を含む群から選択される、天然又は非天然のアミノ酸を示し；Ｚ3は、Ｌ−グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、Ｄ−グルタミン（ｄＱ）、又は式ＩＩの化合物（ＣＮＢ、又はＨｆｌ）を示し；Ｚ4は、グリシン（Ｇ）、又は非天然アミノ酸である１−アミノシクロプロパンカルボン酸（ＡＣＰ）、若しくは１−アミノ−シクロペンタンカルボン酸（ＡＰＰ）を示し；Ｚ5は、ヒドロキシル側鎖を含む、天然又は非天然のアミノ酸を示し；好ましいＺ5は、Ｌ−スレオニン（Ｔ）、Ｄ−スレオニン（ｄＴ）、Ｌ−アロスレオニン（ａｌｌｏ−Ｔｈｒ；ａｌｌｏ−Ｔ）、Ｄ−アロスレオニン（ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ；ｄ−ａｌｌｏ−Ｔ）であり；Ｚ6は、二つの側鎖を有する、二置換されたアルファ炭素を有する、天然又は非天然のアミノ酸を示し、ここで前記側鎖の各々は独立して、場合により置換されたアルキル又はアリール又はアラルキル基であり得、ここで前記置換基は１個以上のアルキル基、又は１個以上のハロ基から選択され得；Ｚ7及びＺ8は独立して、ヒドロキシル側鎖を有する天然又は非天然アミノ酸を示し；Ｚ9は独立して、酸性基を含むアミノ酸側鎖を有する、天然又は非天然のアミノ酸を示し；Ｚ10は、式ＩＩＩ（ａ〜ｃ）のＬ又はＤ非天然アミノ酸を示し；Ｚ11は、式ＩＶ（ａ〜ｌ）のＬ又はＤ非天然アミノ酸を示す］の配列を有する単離されたペプチド模倣体、その互変異性体、又は溶媒和物。
請求項2
Ｚ6が、Ｐｈｅ（Ｆ）、アルファ−メチル−フェニルアラニン（−α−Ｍｅ−Ｐｈｅ−）、アルファ−メチル−２−フルオロフェニルアラニン（−α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ−）、又はアルファ−メチル−２，６−ジフルオロフェニルアラニン（−α−Ｍｅ−２，６−Ｆ−Ｐｈｅ−）、又は２−フルオロフェニルアラニン（−２Ｆ−Ｐｈｅ−）を示す、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
請求項3
Ｚ7及びＺ8のそれぞれが、スレオニン、セリン、１−アミノシクロプロパンカルボン酸から選択される、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
請求項4
Ｚ9が、Ｌ−アスパラギン酸（Ｄ）、Ｄ−アスパラギン酸（ｄＤ）、又は式ＩＩの化合物から選択される、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
請求項5
前記アリール基が、フェニル、ナフチル、インダニル、フルオレニル、又はビフェニル基から選択され；前記ヘテロアリール基が、ピリジル、チエニル、フリル、イミダゾリル、ベンゾフラニル基から選択される、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
請求項6
Ｚ9とＺ10との間の、又はＺ10とＺ11との間の、又はＺ9〜Ｚ11のアミド結合が、さらにＮメチル化され、「ＮＭｅ」と表される、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
請求項7
Ｚ9とＺ10との間の、又はＺ10とＺ11との間の、又はＺ9〜Ｚ11のアミド結合が、さらにチオアミド結合である、請求項１に記載の式（Ｉ）の化合物。
請求項8
さらにＺ9とＺ10との間の、又はＺ10とＺ11との間の、又はＺ9〜Ｚ11の前記チオアミド結合が、「−ＣＨ2−」結合へと還元されている、請求項７に記載の式（Ｉ）の化合物。
請求項9
式（Ｉ）［式中、Ａは−ＮＨ−Ｒ1、Ｒ3−ＣＯ−、Ｒ3−Ｏ−ＣＯ−、又はＲ3−ＳＯ2−を示し、ここでＲ1は、水素、又は場合により置換された直鎖又は分岐の（Ｃ1−Ｃ10）アルキル鎖を示し；Ｒ3は、直鎖又は分岐の（Ｃ1−Ｃ10）アルキル、（Ｃ3−Ｃ6）シクロアルキル、アリール、ヘテロアリール、又はアリールアルキル基から選択され；Ｂは、−ＣＯＯＲ2、−ＣＯＮＨＲ2、又はＣＨ2ＯＲ2を示し、ここでＲ2は、水素、又は、直鎖若しくは分岐の（Ｃ1−Ｃ10）アルキル基、アリール若しくはアラルキル基から選択される、場合により置換された基を示し；Ｚ1は、Ｌ−ヒスチジン（Ｈ）、Ｄ−ヒスチジン（ｄＨ）、又はウロカニン酸（ＵＡ）を示し；Ｚ2は、Ｌ−セリン、Ｄ−セリン、Ｌ−アラニン、Ｄ−アラニン、α−アミノ−イソ酪酸、１−アミノシクロプロパンカルボン酸から選択され；Ｚ3は、Ｌ−グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）、Ｄ−グルタミン（ｄＱ）、又は式ＩＩの化合物（ＣＮＢ、又はＨｆｌ）を示し；Ｚ4は、グリシン（Ｇ）、又は非天然アミノ酸である１−アミノシクロプロパンカルボン酸（ＡＣＰ）、若しくは１−アミノ−シクロペンタンカルボン酸（ＡＰＰ）を示し；Ｚ5は、Ｌ−スレオニン（Ｔ）、Ｄ−スレオニン（ｄＴ）、Ｌ−アロスレオニン（ａｌｌｏ−Ｔｈｒ；ａｌｌｏ−Ｔ）、Ｄ−アロスレオニン（ｄ−ａｌｌｏ−Ｔｈｒ；ｄ−ａｌｌｏ−Ｔ）を示し；Ｚ6は、フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）、アルファ−メチル−フェニルアラニン（−α−Ｍｅ−Ｐｈｅ−）、アルファ−メチル−２−フルオロフェニルアラニン（−α−Ｍｅ−２Ｆ−Ｐｈｅ−）、アルファ−メチル−２，６−ジフルオロフェニルアラニン（−α−Ｍｅ−２，６−Ｆ−Ｐｈｅ−）、又は２−フルオロフェニルアラニン（−２Ｆ−Ｐｈｅ−）を示し；Ｚ7及びＺ8は、スレオニン、セリン、１−アミノシクロプロパンカルボン酸（ＡＣＰ）から独立して選択され；Ｚ9は、Ｌ−アスパラギン酸（Ｄ）、Ｄ−アスパラギン酸（ｄＤ）、又は式ＩＩの化合物から選択され；Ｚ10は、式ＩＩＩ（ａ〜ｃ）のＬ又はＤ非天然アミノ酸を示し；Ｚ11は、式ＩＶ（ａ〜ｌ）のＬ又はＤ非天然アミノ酸を示す］の化合物。
請求項10
から選択される、式Ｉの化合物。
請求項11
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物、及び好適な医薬上許容される担体（単数又は複数）を含む医薬組成物。
請求項12
グルカゴン受容体のアンタゴニストとして作用する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物、又はそれらの医薬組成物。
請求項13
ＧＬＰ−１受容体のアゴニストとしてさらに作用する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物、又はそれらの医薬組成物。
請求項14
高脂血症、高コレステロール血症、高血糖症、高インスリン血症、遊離の脂肪酸又はグリセロールの血液レベルの上昇、高トリグリセリド血症、創傷治癒、耐糖能の減少、レプチン抵抗性、インスリン抵抗性、又は他の糖尿病性合併症によって引き起こされる疾患を処置又は予防するために有用な、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の化合物、又はそれらの医薬組成物。
請求項15
高脂血症、高コレステロール血症、高血糖症、高インスリン血症、遊離の脂肪酸又はグリセロールの血液レベルの上昇、高トリグリセリド血症、創傷治癒、耐糖能の減少、レプチン抵抗性、インスリン抵抗性、又は他の糖尿病性合併症によって引き起こされる疾患を予防又は処置するための方法であって、無毒性な有効量の、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物を、それを必要とする患者へ投与することを含む、前記方法。
請求項16
前記疾患が、２型糖尿病、耐糖能の減少、脂質異常症、高血圧、アテローム性動脈硬化、高脂血症、冠動脈疾患、心血管障害、及びインスリン抵抗性が、内在する病態生理学的機構である他の疾患である、請求項１５に記載の方法。
請求項17
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物、及び医薬上許容される担体、希釈剤、賦形剤、又は溶媒和物を、それを必要とする患者へ投与することを含む、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の任意の疾患症状を処置／軽減するための医薬。
請求項18
請求項１〜１７のいずれか一項に記載の疾患の治療のために好適な薬剤としての、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物、それらの医薬組成物、及びそれらを含む医薬の使用。